
Тип работы:	Предмет:	Язык работы:

Экспериментальная регистрация комплекса бактериальной люциферазы и NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазы

Работа №	18446
Тип работы	Бакалаврская работа
Предмет	биология
Объем работы	35
Год сдачи	2017
Стоимость	4900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено	673

Не подходит работа?

Узнай цену на написание

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4
1 Белок-белковые взаимодействия: виды и методы регистрации (обзор литературы) 5
1.1 Типы белковых взаимодействий 5
1.2 Теоретические и экспериментальные методы изучения взаимодействия
между белками 7
1.2.1 Теоретические (биоинформационные) подходы 7
1.2.2 Экспериментальные подходы 9
1.3 Взаимодействие между белками в биолюминесцентной системе бактерий 19
1.4 Исследования комплекса бактериальной люциферазы и NAD(P)H:FMN-
оксидоредуктазы другими авторами 23
2 Материалы и методы исследований 27
3 Результаты и обсуждение
3.2.2 Построение математической модели взаимодействия белков ..
3.2.3 Экспериментальное титрование NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазы
люциферазой
3.3 Регистрация взаимодействия между белками с помощью время-разрешенной анизотропии флуоресценции
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 29
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 31

Введение

Изучение взаимодействия между белками - широко представленная в современной биологии область. Знания о межбелковых контактах помогают понять фундаментальные основы биохимических реакций в клетке, что, в свою очередь, позволяет применять эти знание in vitro для управления активностью и стабильностью биохимических систем.
Образование комплекса между редуктазой и люциферазой бактерий уже исследовалось с помощью различных методов [1]. Предпосылкой для поиска комплекса между этими белками является, в частности, факт, что восстановленный флавинмононуклеотид (продукт оксидоредуктазы и субстрат люциферазы), не может существовать в клетке в свободном виде, так как подвергается быстрому автоокислению. С другой стороны, однозначного экспериментального доказательства присутствия комплекса в смеси этих двух ферментов так и не было получено [2, 3].
Среди экспериментальных методов, используемых для регистрации ассоциации белков, высокой чувствительностью и неинвазивностью обладают флуоресцентные методики, основанные, в частности, на явлении поляризации испускаемого молекулами света. При изучении белков часто используют флуоресцентные метки, обеспечивающие люминесценцию наблюдаемого объекта в видимом диапазоне.
Целью данной работы являлась разработка методики экспериментальной регистрации комплекса между бактериальной люциферазой и NAD(P)H:FMN- оксидоредуктазой на основе анизотропии собственной флуоресценции этих белков.

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь студентам в написании работ!

ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Курсовые Статьи Диплом Рязань

Заключение

В ходе представленного исследования взаимодействия между ферментами биолюминесцентной системы бактерий - люциферазой и NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазой - были опробованы и модифицированы несколько флуоресцентных методик определения непостоянных слабых белок¬белковых комплексов. В качестве источника сигнала люминесценции были выбраны внутренние флуорофоры исследованных белков - триптофановые остатки и эндогенный флавин. Главным преимуществом такого подхода является отсутствие необходимости изменения нативной структуры и конформации белка, что обеспечивает достоверность получаемых результатов.
Наиболее эффективной методикой оказалась регистрация стационарной анизотропии собственной (триптофановой) флуоресценции белков. Данная технология показала хороший сигнал даже при маленьких концентрациях белков и тем самым позволила провести титрование белков и определить константу диссоциации комплекса. Недостатком данной технологии является сложность обработки результатов и необходимость заранее знать некоторые параметры ожидаемого белок-белкового комплекса.
Регистрация время-разрешенной анизотропии флуоресценции эндогенного флавина также оказалась перспективной методикой. Главным ее преимуществом является прямое экспериментальное получение информации о размерах белковой молекулы или комплекса, к которому прикреплён флуорофор. Но оказалось, что низкое значение соотношения сигнал/шум при использовании в качестве флуорофора эндогенного флавина не позволяет с большой точностью определить параметры комплекса.
В результате выполненного исследования были сделаны следующие выводы:
1. Оксидоредуктазы бактерий A. fischeri и P. leiognathi имеют сходное
распределение электростатического потенциала в области активного
центра, поэтому могут взаимодействовать с бактериальной
люциферазой по аналогичному механизму.
29
2. Метод анизотропии собственной флуоресценции белков при стационарном возбуждении свидетельствует об образовании комплекса между NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазой и бактериальной люциферазой с константой диссоциации около 0,2 mM.
3. Метод время-разрешенной анизотропии флуоресценции эндогенного флавина NAD(P)H:FMN-оксидоредуктазы показывает увеличение времени вращательной корреляции после добавления бактериальной люциферазы, что может быть подтверждением образования комплекса между белками.

Литература

1. Sucharitakul, J. Mechanisms of reduced flavin transfer in the two- component flavin-dependent monooxygenases / J. Sucharitakul, R. Tinikul, P. Chaiyen //Archives of biochemistry and biophysics. - 2014. - Т. 555. - С. 33-46.
2. Low, J. C. Energy transfer evidence for in vitro and in vivo complexes of Vibrio harveyi flavin reductase P and luciferase / J. C. Low, S. C. Tu //Photochemistry and photobiology. - 2003. - Т. 77. - №. 4. - С. 446-452.
3. Jeffers, C. E. Complex formation between Vibrio harveyi luciferase and monomeric NADPH: FMN oxidoreductase / C. E. Jeffers, J. C. Nichols, S. C. Tu //Biochemistry. - 2003. - Т. 42. - №. 2. - С. 529-534.
4. Иванов, А.С. Технологии белковой интерактомики / А.С. Иванов, В.Г. Згода, А.И. Арчаков // Биоорганическая химия. - 2011. - Т.37 - №.1. - С. 8-21.
5. Jones, S. Principles of protein-protein interactions / S. Jones, J.M. Thornton // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1999. - T.93. - №.1. - C.13- 20.
6. Acuner Ozbabacan, S. E. Transient protein-protein interactions / S. E Acuner Ozbabacan, H.B. Engin, A. Gursoy, O. Keskin //Protein engineering, design and selection. - 2011. - Т. 24. - №. 9. - С. 635-648.
7. Marcotte, E. M. Computational genetics: finding protein function by nonhomology methods / E.M. Marcotte //Current opinion in structural biology. -
2000. - Т. 10. - №. 3. - С. 359-365.
8. Pazos, F. Similarity of phylogenetic trees as indicator of protein-protein interaction / F. Pazos , A. Valencia //Protein engineering. - 2001. - Т. 14. - №. 9. - С. 609-614.
9. Aloy, P. Interrogating protein interaction networks through structural biology / P. Aloy, R.B. Russell //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. - Т. 99. - №. 9. - С. 5896-5901.
10. Tan, S. H. A correlated motif approach for finding short linear motifs from protein interaction networks / S.H. Tan, W. Hugo, W.K. Sung, S.K. Ng //BMC bioinformatics. - 2006. - Т. 7. - №. 1. - С. 502.
11. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение, Пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак. - Москва: Мир, 2002. - 589 с., ил.
12. Yan Tong, A. H. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae / A.H. Yan Tong, C. Boone //Yeast Protocol. - 2006. - С. 171-191.
13. Ge, H. Correlation between transcriptome and interactome mapping data from Saccharomyces cerevisiae/ H. Ge, Z. Liu, G.M. Church, M. Vidal //Nature genetics. - 2001. - Т. 29. - №. 4. - С. 482-486.
14. Phizicky, E. M. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis / E. M. Phizicky, S. Fields // Microbiological reviews. - 1995. - Т. 59. - №.1. - С. 94-123.
15. Free, R. B. Identifying novel protein-protein interactions using co-immunoprecipitation and mass spectroscopy/ R.B. Free, L.A. Hazelwood, D.R. Sibley //Current Protocols in Neuroscience. - 2009. - T.28. - №.5. - С. 1-14.
16. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии, пер. с анг. / Дж. Лакович. - Москва : Мир, 1986. - C. 496, с ил.
17. Немцева, Е.В. Поляризационные исследования флуоресценции биологических объектов / Е.В. Немцева, В.А. Кратасюк. - Красноярск, 2012. - C. 34, с ил.
18. Lin, L. Bacterial bioluminescence biochemistry and molecular biology [Электронный ресурс] / L. Lin, E. Meighen // Photobiological Sciences Online (KC Smith, ed.) American Society for Photobiology. - 2009. - Режим доступа: http://photobiology.info/Lin.html.
19. Дерябин, Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты / Д.Г. Дерябин. - Москва : Наука, 2009. - С. 248, с ил.
20. Miyashiro, T. Shedding light on bioluminescence regulation in Vibrio fischeri / T. Miyashiro, E. G. Ruby //Molecular microbiology. - 2012. - №84(5). - C. 795-806.
21. Jeffers, C. E. Differential transfers of reduced flavin cofactor and product by bacterial flavin reductase to luciferase / C. E. Jeffers, S. C. Tu //Biochemistry. -
2001. - Т. 40. - №. 6. - С. 1749-1754.
22. Tu, S. C. Activity coupling and complex formation between bacterial luciferase and flavin reductases / S. C. Tu //Photochemical & Photobiological Sciences. - 2008. - Т. 7. - №. 2. - С. 183-188.
23. Tu, S. C. Structural studies on bacterial luciferase using energy transfer and emission anisotropy / S. C. Tu, C. W. Wu, J. W. Hastings //Biochemistry. - 1978. - Т. 17. - №. 6. - С. 987-993.
24. Boute, N. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET / N. Boute, R. Jockers, T. Issad //Trends in pharmacological sciences. - 2002. - Т. 23. - №. 8. - С. 351-354.
25. Коваль, А. А. Молекулярное моделирование взаимодействия бактериальной люциферазы и NADPH:FMN-оксидоредуктазы [электронный ресурс] / А.А. Коваль // Молодежь и наука: сборник материалов 1Х всероссийской научно-технической конференции - Красноярск : Сиб. федер. ун-т., 2013. - Режим доступа: http://conf.sfu-kras.ru/sites/mn2013/thesis/s093/s093- 019.pdf .
26. Koval, A. Docking of bacterial luciferase and NADPH: FMN- oxidoreductase using continuum electrostatic method / A. Koval, E. Nemtseva, M. Ullmann //The FEBS Journal. - 2013. - Т. 280. - №. 1. - С. 549
27. Baker, N.A. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome / N.A. Baker, D. Sept, S. Joseph, M.J. Holst, J.A. McCammon //Proc. Natl. Acad. Sci. - 1998. - C. 10037-10041.
28. Tanner, J. J. Flavin reductase P: structure of a dimeric enzyme that reduces flavin / J. J. Tanner //Biochemistry. - 1996. - Т. 35. - №. 42. - С. 13531-13539.
29. Koike, H. 1.8 A crystal structure of the major NAD(P)H:FMN oxidoreductase of a bioluminescent bacterium, Vibrio fischeri: overall structure, cofactor and substrate-analog binding, and comparison with related flavoproteins / H. Koike //Journal of molecular biology. - 1998. - Т. 280. - №. 2. - С. 259-273.
30. Altschul, S. F. Basic local alignment search tool / S. F. Altschul //Journal of molecular biology. - 1990. - Т. 215. - №. 3. - С. 403-410.
31. Mandel, M. J. Comparative genomics-based investigation of resequencing targets in Vibrio fischeri: focus on point miscalls and artefactual expansions / M. J. Mandel, E. V. Stabb, E. G. Ruby //BMC genomics. - 2008. - Т. 9. - №. 1. - С. 1.
32. Zenno, S. Identification of the gene encoding the major NAD (P) H-flavin oxidoreductase of the bioluminescent bacterium Vibrio fischeri ATCC 7744 / S. Zenno //Journal of bacteriology. - 1994. - Т. 176. - №. 12. - С. 3536-3543.
33. Fisher, A. J. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2.4. A resolution / A. J. Fisher //Biochemistry. - 1995. - Т. 34. - №. 20. - С. 6581-6586.
34. Lei, B. Vibrio harveyi NADPH-flavin oxidoreductase: cloning, sequencing and overexpression of the gene and purification and characterization of the cloned enzyme / B. Lei //Journal of bacteriology. - 1994. - Т. 176. - №. 12. - С. 3552-3558.
35. Ast, J. C Phylogenetic analysis of the lux operon distinguishes two evolutionarily distinct clades of Photobacterium leiognathi / J.C. Ast, P.V. Dunlap //Archives of microbiology. - 2004. - Т. 181. - №. 5. - С. 352-361.
36. Humphrey, W., Dalke, A. and Schulten, K., "VMD - Visual Molecular Dynamics", J. Molec. Graphics, 1996, vol. 14, pp. 33-38.
37. Liu, M. Vibrio harveyi NADPH: FMN Oxidoreductase: Preparation and characterization of the apoenzyme and monomer-dimer equilibrium / M. Liu //Archives of biochemistry and biophysics. - 1997. - Т. 337. - №. 1. - С. 89-95.
38. Tang, C. K. Flavin specificity and subunit interaction of Vibrio fischeri general NAD (P) H-flavin oxidoreductase FRG/FRase I / C. K. Tang //Archives of biochemistry and biophysics. - 2001. - Т. 392. - №. 1. - С. 110-116.
39. Richmond, T. J. Solvent accessible surface area and excluded volume in proteins: Analytical equations for overlapping spheres and implications for the hydrophobic effect / T.J. Richmond //Journal of molecular biology. - 1984. - Т. 178. - №. 1. - С. 63-89.
40. Vetrova, E.V. Characteristics of endogeneous flavin fluorescence of Photobacterium leiognathi luciferase and Vibrio fischeri NAD(P)H:FMN- oxidoreductase / E.V. Vetrova, N.S. Kudryasheva, A.J.W.G. Visser, A. Van Hoek // Luminescence. - 2005. - Т. 20. - №. 3. - С. 205-209.
41. Vetrova, E.V. Effect of quinone on the fluorescence decay dynamics of endogenous flavin bound to bacterial luciferase / E.V. Vetrova, N.S. Kudryasheva, K.H. Cheng // Biophysical chemistry. - 2009. - T. 141. - №. 1. - C. 59-65.