Молекулярно-генетическая конструкция для детекции бактерий рода Campylobacter в различных средах
|
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Микрофлора кишечника и ее роль в развитии заболеваний 8
1.2. Нарушение микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у больных 11
1.3. Общие представления о Campylobacter 13
1.4. Кампилобактерии в стуле больных синдромом раздраженного кишечника 15
1.5. Патогенность Campylobacter fetus subspecies в структуре акушерско-гинекологических инфекционных осложнений беременных 17
1.6. Эпидемиология 19
1.7. Маркеры кишечного воспаления при заболеваниях кишечника 20
1.8. Лабораторные методы исследования 21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Клинико-лабораторное обследование больных 25
2.2. Выделение бактериальной ДНК 25
2.3. Подбор родоспецифичных праймеров 28
2.4. Амплификация участков ДНК методом ПЦР 29
2.5. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 33
2.6. Высокотемпературная демаскировка биоптатов (1 способ) 34
2.7. Выделение ДНК из биоптатов 35
2.8. Депарафинизация и оптимизация метода выделения ДНК из ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин (2 способ) 37
2.9. Амплификация участков ДНК методом полимеразной цепной реакции с помощью подобранных праймеров 39
2.10. Проведение ПЦР в режиме реального времени 39
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Подбор оптимальных праймеров для ПЦР-идентификации Campylobacter spp. 42
3.2. Проверка специфичности праймеров на Campylobacter spp. 44
3.3. Анализ представленности патогенных Campylobacter в исследуемом клиническом материале 44
3.4. Выделение ДНК из биоптатов 45
3.5. Результаты ПЦР-анализа и ПЦР в режиме реального времени 46
3.6. Оптимизация условий для проведения ПЦР в режиме реального времени 47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
ВЫВОДЫ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 51
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Микрофлора кишечника и ее роль в развитии заболеваний 8
1.2. Нарушение микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у больных 11
1.3. Общие представления о Campylobacter 13
1.4. Кампилобактерии в стуле больных синдромом раздраженного кишечника 15
1.5. Патогенность Campylobacter fetus subspecies в структуре акушерско-гинекологических инфекционных осложнений беременных 17
1.6. Эпидемиология 19
1.7. Маркеры кишечного воспаления при заболеваниях кишечника 20
1.8. Лабораторные методы исследования 21
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Клинико-лабораторное обследование больных 25
2.2. Выделение бактериальной ДНК 25
2.3. Подбор родоспецифичных праймеров 28
2.4. Амплификация участков ДНК методом ПЦР 29
2.5. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 33
2.6. Высокотемпературная демаскировка биоптатов (1 способ) 34
2.7. Выделение ДНК из биоптатов 35
2.8. Депарафинизация и оптимизация метода выделения ДНК из ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин (2 способ) 37
2.9. Амплификация участков ДНК методом полимеразной цепной реакции с помощью подобранных праймеров 39
2.10. Проведение ПЦР в режиме реального времени 39
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Подбор оптимальных праймеров для ПЦР-идентификации Campylobacter spp. 42
3.2. Проверка специфичности праймеров на Campylobacter spp. 44
3.3. Анализ представленности патогенных Campylobacter в исследуемом клиническом материале 44
3.4. Выделение ДНК из биоптатов 45
3.5. Результаты ПЦР-анализа и ПЦР в режиме реального времени 46
3.6. Оптимизация условий для проведения ПЦР в режиме реального времени 47
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 49
ВЫВОДЫ 50
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 51
Актуальность проблемы. Неспецифический язвенный колит (НЯК) является одной из сложнейших проблем в современной гастроэнтерологии. В его основе лежит диффузное язвенно-воспалительное поражение толстой кишки, что клинически проявляется частым жидким стулом с гноем и кровью, кишечными кровотечениями, сильными болями в брюшной области, тенезмами и запорами (Дорофеев, 2004). Предполагается, что в патогенезе данного заболевания имеет значение иммунологическая реактивность, дисбиотические сдвиги, различные аллергические реакций, а также генетические факторы и психические нарушения.
По данным ВОЗ распространенность НЯК по миру составляет от 50 до 230 случаев на сто тысяч населения. А ежегодный прирост больных заболевание в мире достигает от 5 до 20 случаев на сто тысяч населения. Смертность от воспаления кишечника, в том числе от болезни Крона и неспецифического язвенного колита, составляет примерно в мире 6 случаев на 1 млн населения, в России - 17 случаев на один миллион населения. В России чаще всего диагноз ставится через несколько лет от момента появления первых симптомов данного заболевания.
Хотя точная этиология заболевания до сих пор не ясна (Полуэктова, 2014), считается, что в основе важное значение имеет воспаление преимущественно аутоиммунного характера и также активное действие различных бактериальных агентов (Дорофеев, 2014). К таким агентам относятся бактерии рода Campylobacter, которые имеют тропность к тканям слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, обладающие высокой адгезивностью и инвазивностью по отношению к энтероцитам и колоноцитам, а также продуцируют эндотоксин и экзотоксины (холероподобный энтеротоксин, дизентериеподобный цитотоксин и цитолетальный токсин). Клиническое значение имеют виды Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter fetus subsp. fetus, Campylobacter psaliensis, Campylobacter lari, Campylobacter jejuni subsp. doylei.
Campylobacter spp. концентрируются в слизистой оболочке толстого кишечника, а в кале их концентрация очень низкая. Они крайне плохо окрашиваются, не растут на простых питательных средах и не растут в воздушной среде.
Сочетание заболевания с различными проявлениями других симптомов вызывает разного рода трудности в его диагностике на начальных этапах. С момента возникновения первой симптоматики до установления точного диагноза может пройти несколько месяцев и, в редких случаях, лет. (Langan, 2007). Лабораторная диагностика язвенного колита предполагает, изначально, дифференцировку заболевания с инфекционными поражениями кишечника, ишемическим колитом и болезнью Крона. Вместе с тем, при НЯК на первый план часто выходят внекишечные проявления, которые встречаются практически у половины пациентов. В связи с этим целью дипломной работы является молекулярно-генетическая конструкция для детекции бактерий рода Campylobacter у клинически больных.
Цель работы. Разработка прототипа тест-системы для родоспецифичной детекции Campylobacter spp. в биоптатах для этиологической диагностики воспалительных заболеваний кишечника и оценки эффективности их этиотропной терапии в динамике.
Задачи исследования:
1. Сбор клинического материала.
2. Выделение бактериальной ДНК из собранного клинического материала больных.
3. Подбор родоспецифичных праймеров для выявления бактерий рода Campylobacter.
4. Поиск эффективного метода демаскировки биоптатов.
5. Оптимизация работы с подобранными праймерами и биоптатами.
Практическая значимость. Подобранные олигонуклеотидные родоспецефичные праймеры к последовательности гена 16S рРНК Campylobacter различных видов позволит выявить в клиническом материале спектр вышеперечисленных возбудителей с помощью ПЦР. Предложенный подход позволит разработать оптимальный метод и наборы реагентов для пробоподготовки и ПЦР обнаружения Campylobacter spp. непосредственно в биоптатах, получаемых для гистологического исследования.
Область применения результатов исследования. Разработанная в ходе исследования методика демаскировки биоптатов применима для широкого использования, не требует дорогостоящей реагентики и непродолжительна во времени. Детекция бактерий рода Campylobacter может стать основой при постановке диагноза и дальнейшего этиотропного лечения больных. Результаты проделанной работы могут быть применимы в медицине, лабораторной диагностике для выявления Campylobacter spp. и при назначении висмутсодержащих препаратов против них.
По данным ВОЗ распространенность НЯК по миру составляет от 50 до 230 случаев на сто тысяч населения. А ежегодный прирост больных заболевание в мире достигает от 5 до 20 случаев на сто тысяч населения. Смертность от воспаления кишечника, в том числе от болезни Крона и неспецифического язвенного колита, составляет примерно в мире 6 случаев на 1 млн населения, в России - 17 случаев на один миллион населения. В России чаще всего диагноз ставится через несколько лет от момента появления первых симптомов данного заболевания.
Хотя точная этиология заболевания до сих пор не ясна (Полуэктова, 2014), считается, что в основе важное значение имеет воспаление преимущественно аутоиммунного характера и также активное действие различных бактериальных агентов (Дорофеев, 2014). К таким агентам относятся бактерии рода Campylobacter, которые имеют тропность к тканям слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, обладающие высокой адгезивностью и инвазивностью по отношению к энтероцитам и колоноцитам, а также продуцируют эндотоксин и экзотоксины (холероподобный энтеротоксин, дизентериеподобный цитотоксин и цитолетальный токсин). Клиническое значение имеют виды Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter fetus subsp. fetus, Campylobacter psaliensis, Campylobacter lari, Campylobacter jejuni subsp. doylei.
Campylobacter spp. концентрируются в слизистой оболочке толстого кишечника, а в кале их концентрация очень низкая. Они крайне плохо окрашиваются, не растут на простых питательных средах и не растут в воздушной среде.
Сочетание заболевания с различными проявлениями других симптомов вызывает разного рода трудности в его диагностике на начальных этапах. С момента возникновения первой симптоматики до установления точного диагноза может пройти несколько месяцев и, в редких случаях, лет. (Langan, 2007). Лабораторная диагностика язвенного колита предполагает, изначально, дифференцировку заболевания с инфекционными поражениями кишечника, ишемическим колитом и болезнью Крона. Вместе с тем, при НЯК на первый план часто выходят внекишечные проявления, которые встречаются практически у половины пациентов. В связи с этим целью дипломной работы является молекулярно-генетическая конструкция для детекции бактерий рода Campylobacter у клинически больных.
Цель работы. Разработка прототипа тест-системы для родоспецифичной детекции Campylobacter spp. в биоптатах для этиологической диагностики воспалительных заболеваний кишечника и оценки эффективности их этиотропной терапии в динамике.
Задачи исследования:
1. Сбор клинического материала.
2. Выделение бактериальной ДНК из собранного клинического материала больных.
3. Подбор родоспецифичных праймеров для выявления бактерий рода Campylobacter.
4. Поиск эффективного метода демаскировки биоптатов.
5. Оптимизация работы с подобранными праймерами и биоптатами.
Практическая значимость. Подобранные олигонуклеотидные родоспецефичные праймеры к последовательности гена 16S рРНК Campylobacter различных видов позволит выявить в клиническом материале спектр вышеперечисленных возбудителей с помощью ПЦР. Предложенный подход позволит разработать оптимальный метод и наборы реагентов для пробоподготовки и ПЦР обнаружения Campylobacter spp. непосредственно в биоптатах, получаемых для гистологического исследования.
Область применения результатов исследования. Разработанная в ходе исследования методика демаскировки биоптатов применима для широкого использования, не требует дорогостоящей реагентики и непродолжительна во времени. Детекция бактерий рода Campylobacter может стать основой при постановке диагноза и дальнейшего этиотропного лечения больных. Результаты проделанной работы могут быть применимы в медицине, лабораторной диагностике для выявления Campylobacter spp. и при назначении висмутсодержащих препаратов против них.
В ходе выполнения данной работы были подобраны олигонуклеотидные праймеры к уникальным участкам ДНК для идентификации бактерий рода Campylobacter. Подобранные праймеры удалось апробировать и оптимизировать их работу за счёт снижения температуры отжига.
Методом ПЦР был проанализирован клинический материал (фекалии) 56-ти больных на наличие кампилобактерий и 20 бипотатов. При этом в клинических образцах, выделенных их фекалий ДНК бактерий рода Campylobacter не были обнаружены. Все исследуемые образцы биоптатов показали положительный результат при амплификации в режиме реального времени.
Для выделения ДНК из биоптатов были использованы 2 способа демаскировки. Первый способ - это высокотемпературная демаскировка биоптатов, в результате которой не была детектирована ДНК бактерий рода Campylobacter. Второй способ - депарафинизация и оптимизация метода выделения ДНК из ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин дал результат. Все 20 исследуемых образцов были положительными при амплификации в режиме реального времени. Таким образом, второй использованный метод был наиболее подходящим для выделения ДНК из биоптатов и имел больше преимуществ перед предыдущим методом: быстрый лизис ткани, отсутствие органических растворителей и в несколько раз ниже стоимость, что позволяет рекомендовать его для широкой клинико-лабораторной практики.
Таким образом, созданы и испытаны на клиническом материале олигонуклеотидные праймеры, пригодные для создания диагностических системы для идентификации при помощи ПЦР в режиме реального времени микроорганизмов рода Campylobacter.
Методом ПЦР был проанализирован клинический материал (фекалии) 56-ти больных на наличие кампилобактерий и 20 бипотатов. При этом в клинических образцах, выделенных их фекалий ДНК бактерий рода Campylobacter не были обнаружены. Все исследуемые образцы биоптатов показали положительный результат при амплификации в режиме реального времени.
Для выделения ДНК из биоптатов были использованы 2 способа демаскировки. Первый способ - это высокотемпературная демаскировка биоптатов, в результате которой не была детектирована ДНК бактерий рода Campylobacter. Второй способ - депарафинизация и оптимизация метода выделения ДНК из ткани, фиксированной в формалине и заключенной в парафин дал результат. Все 20 исследуемых образцов были положительными при амплификации в режиме реального времени. Таким образом, второй использованный метод был наиболее подходящим для выделения ДНК из биоптатов и имел больше преимуществ перед предыдущим методом: быстрый лизис ткани, отсутствие органических растворителей и в несколько раз ниже стоимость, что позволяет рекомендовать его для широкой клинико-лабораторной практики.
Таким образом, созданы и испытаны на клиническом материале олигонуклеотидные праймеры, пригодные для создания диагностических системы для идентификации при помощи ПЦР в режиме реального времени микроорганизмов рода Campylobacter.
