Идентификация генов, регулирующих биосинтез экзополисахаридов у бактерий рода Rhizobium
|
Список сокращений и условных обозначений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Характеристика бактерий рода Rhizobium 9
1.2. Химическая структура ризобиальных экзополисахаридов 10
1.3. Гены, участвующие в синтезе ЭПС у R. leguminosarum 12
1.4. Синтез ЭПС у ризобий 18
1.5. Регулирование синтеза ЭПС у R. leguminosarum 20
1.6. Проблемы, связанные с регулированием образования биопленок
патогенных микроорганизмов 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1. Объекты исследования 27
2.2. Выделение ДНК 27
2.3. Культивирование и питательные среды 28
2.4. Подбор специфичных праймеров к исследуемым генам 29
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 30
2.6. Электрофорез 32
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 34
3.1. Проведение анализа последовательностей генов, участвующих в
биосинтезе ЭПС 34
3.2. Подбор специфичных праймеров к исследуемым генам 36
3.3. Выделение ризобиальной ДНК и амплификация исследуемых генов 39
3.4. Идентификация геновpssA, pssB, prsD, prsE и rosR у R. leguminosarum 43
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
ВЫВОДЫ 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 58
ПРИЛОЖЕНИЕ 67
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Характеристика бактерий рода Rhizobium 9
1.2. Химическая структура ризобиальных экзополисахаридов 10
1.3. Гены, участвующие в синтезе ЭПС у R. leguminosarum 12
1.4. Синтез ЭПС у ризобий 18
1.5. Регулирование синтеза ЭПС у R. leguminosarum 20
1.6. Проблемы, связанные с регулированием образования биопленок
патогенных микроорганизмов 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 27
2.1. Объекты исследования 27
2.2. Выделение ДНК 27
2.3. Культивирование и питательные среды 28
2.4. Подбор специфичных праймеров к исследуемым генам 29
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 30
2.6. Электрофорез 32
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 34
3.1. Проведение анализа последовательностей генов, участвующих в
биосинтезе ЭПС 34
3.2. Подбор специфичных праймеров к исследуемым генам 36
3.3. Выделение ризобиальной ДНК и амплификация исследуемых генов 39
3.4. Идентификация геновpssA, pssB, prsD, prsE и rosR у R. leguminosarum 43
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
ВЫВОДЫ 57
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 58
ПРИЛОЖЕНИЕ 67
В род Rhizobium объединены почвенные бактерии, вызывающие образование специальных структур (клубеньков) на корнях бобовых растений. Внутри этих клубеньков, в условиях симбиоза ризобии способны фиксировать азот, путем восстановления атмосферного азота до аммиака ферментативным комплексом - нитрогеназой (Janczarek, 2011).
Первоначальным этапом в формировании симбиотических отношений является прикрепление ризобий к поверхности корней растения-хозяина, путем обратимого и неспецифического связывания. Такое прикрепление представляет собой начальный этап формирования ризобиями биопленок на корнях растений. Наиболее важная роль в данном процессе принадлежит кислым внеклеточным полисахаридам или экзополисахаридам (ЭПС), синтезируемые азотфиксирующими бактериями (Rinaudi et al., 2010).
Изучение биопленок в настоящее время вызывает огромный интерес исследователей, главным образом, в связи с тем, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике, поскольку они часто образуются при различных инфекционных патологиях. Течение инфекционных болезней может протекать с осложнениями именно из-за формирования в организме микробных биопленок. С биопленочными инфекциями связаны многие хронические заболевания - муковисцидозная пневмония, средний отит, патология зубов и околозубных тканей, остеомиелит, инфекции мочевыводящих путей и другие. В виду этого важно изучать процессы генетического контроля образования биопленок (Глушанова и др., 2015).
Однако, генетический контроль образования биопленок изучен недостаточно. В данном исследовании мы остановимся лишь на нескольких факторах генетической регуляции формирования бактерий и ограничимся генами: pssA, ответственным за инициацию биосинтеза ЭПС (Ivashina et al., 1994), pssB, кодирующим инозитолмонофосфатазу (Janczarek, 2011), rosR, ответственным за регуляцию транскрипции (Janczarek, 2011), и prsD и prsE, отвечающим за секрецию белка NodO, который играет роль в передаче сигналов в процессе образования клубеньков (Skorupska et al., 2006).
Накопленные данные подтверждают важность генетического контроля синтеза экзополисахаридов и изучения их биологических функций в симбиотических взаимодействиях между ризобиями и растением-хозяином.
Цель исследования
Целью данной работы являлась идентификация генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, регулирующих биосинтез экзополисахаридов у бактерий рода Rhizobium.
Задачи исследования
1. Проведение сравнительного анализа последовательностей генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE зарегистрированных в GenBank.
2. Подбор специфичных праймеров к исследуемым генам.
3. Выделение геномной ДНК из ризобактерий.
4. Амплификация генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE.
5. Секвенирование, полученных при амплификации генов pssA, pssB, rosR,
prsD, prsE, последовательностей ДНК и их сравнение с
последовательностями представленными в GenBank.
6. Скрининг штаммов Rhizobium leguminosarum на наличие генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE.
Обоснование новизны исследования
Для бактерий рода Rhizobium провели сравнительный анализ последовательностей генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE, зарегистрированных в GenBank. Подобрали специфичные праймера, франкирующие структурную часть каждого гена для штаммов Rhizobium leguminosarum. Провели секвенирование последовательностей ДНК, амплифицированных с помощью подобранных праймеров. Данные полученные при секвенировании исследуемых последовательностей подтвердили их идентичность с последовательностями, представленными в GenBank. Таким образом, впервые был проведен скрининг 99 штаммов R. leguminosarum из коллекции ИБГ УНЦ РАН. В результате скрининга был выявлен 1 штамм ризобий, содержащий все исследуемые гены, регулирующие биосинтез ЭПС. Ген pssA, ответственный за инициацию биосинтеза экзополисахаридов, был идентифицирован у 26 ризобиальных штаммов, ген pssB, кодирующий инозитолмонофосфатазу - у 21, ген rosR, ответственный за регуляцию транскрипции - у 31, гены prsD и prsE, отвечающие за секрецию белка NodO - у 20 и 21 ризобиального штамма соответственно.
Теоретическая значимость и практическая ценность полученных
результатов
Проведенное исследование показывает оценку степени важности генетического контроля биосинтеза ЭПС в процессе образования ризобиальных биопленок. Поскольку, ЭПС играют решающую роль в прикрепление бактерий к поверхностям, в установлении симбиотических отношений с бобовыми растениями, в питании и защите от вредных факторов окружающей среды. В данной работе было показано, как наличие генов ЭПС влияет на образование биопленок.
В рамках исследования, был проведен скрининг 99 штаммов R. leguminosarum из коллекции ИБГ УНЦ РАН на предмет наличия у них генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, регулирующих биосинтез ЭПС. В результате скрининга был выявлен 1 штамм ризобий, содержащий все исследуемые гены и 23 штамма, у которых не было обнаружено ни одного из представленных генов. Такие штаммы характеризовались скудным ослизнением клеток, по сравнению с другими штаммами. Данное исследование показало, как наличие генов, ответственных за синтез ЭПС, влияет на образование ризобиальных биопленок.
Полученные результаты раскрывают функциональную особенность каждого из исследуемых генов, участвующих в биосинтезе ЭПС в процессах, связанных с образованием ризобактериями биопленок, показывают их роль в установлении симбиотических отношений и выживании ризобактерий в естественных условиях ризосферы. Чем больше ризобии синтезируют ЭПС, тем выше их конкурентоспособность по сравнению с другими штаммами
В медицинской практике формирование биопленок создаёт большую проблему из-за трудностей борьбы с ними. Так, методы идентификации и изучение генов, которые участвуют в образовании патогенных биопленок в организме человека, позволяют найти способ борьбы с биопленками, путём регулирования этих генов, что приведет к тому, что бактерии окажутся неспособны образовывать биопленки.
Проведенное нами исследование, свидетельствуют о существенной роли изучения генетической регуляции ЭПС не только у ризобиальных биопленок, но и у биопленок, образованными патогенными бактериями в организме человека.
Первоначальным этапом в формировании симбиотических отношений является прикрепление ризобий к поверхности корней растения-хозяина, путем обратимого и неспецифического связывания. Такое прикрепление представляет собой начальный этап формирования ризобиями биопленок на корнях растений. Наиболее важная роль в данном процессе принадлежит кислым внеклеточным полисахаридам или экзополисахаридам (ЭПС), синтезируемые азотфиксирующими бактериями (Rinaudi et al., 2010).
Изучение биопленок в настоящее время вызывает огромный интерес исследователей, главным образом, в связи с тем, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике, поскольку они часто образуются при различных инфекционных патологиях. Течение инфекционных болезней может протекать с осложнениями именно из-за формирования в организме микробных биопленок. С биопленочными инфекциями связаны многие хронические заболевания - муковисцидозная пневмония, средний отит, патология зубов и околозубных тканей, остеомиелит, инфекции мочевыводящих путей и другие. В виду этого важно изучать процессы генетического контроля образования биопленок (Глушанова и др., 2015).
Однако, генетический контроль образования биопленок изучен недостаточно. В данном исследовании мы остановимся лишь на нескольких факторах генетической регуляции формирования бактерий и ограничимся генами: pssA, ответственным за инициацию биосинтеза ЭПС (Ivashina et al., 1994), pssB, кодирующим инозитолмонофосфатазу (Janczarek, 2011), rosR, ответственным за регуляцию транскрипции (Janczarek, 2011), и prsD и prsE, отвечающим за секрецию белка NodO, который играет роль в передаче сигналов в процессе образования клубеньков (Skorupska et al., 2006).
Накопленные данные подтверждают важность генетического контроля синтеза экзополисахаридов и изучения их биологических функций в симбиотических взаимодействиях между ризобиями и растением-хозяином.
Цель исследования
Целью данной работы являлась идентификация генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, регулирующих биосинтез экзополисахаридов у бактерий рода Rhizobium.
Задачи исследования
1. Проведение сравнительного анализа последовательностей генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE зарегистрированных в GenBank.
2. Подбор специфичных праймеров к исследуемым генам.
3. Выделение геномной ДНК из ризобактерий.
4. Амплификация генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE.
5. Секвенирование, полученных при амплификации генов pssA, pssB, rosR,
prsD, prsE, последовательностей ДНК и их сравнение с
последовательностями представленными в GenBank.
6. Скрининг штаммов Rhizobium leguminosarum на наличие генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE.
Обоснование новизны исследования
Для бактерий рода Rhizobium провели сравнительный анализ последовательностей генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE, зарегистрированных в GenBank. Подобрали специфичные праймера, франкирующие структурную часть каждого гена для штаммов Rhizobium leguminosarum. Провели секвенирование последовательностей ДНК, амплифицированных с помощью подобранных праймеров. Данные полученные при секвенировании исследуемых последовательностей подтвердили их идентичность с последовательностями, представленными в GenBank. Таким образом, впервые был проведен скрининг 99 штаммов R. leguminosarum из коллекции ИБГ УНЦ РАН. В результате скрининга был выявлен 1 штамм ризобий, содержащий все исследуемые гены, регулирующие биосинтез ЭПС. Ген pssA, ответственный за инициацию биосинтеза экзополисахаридов, был идентифицирован у 26 ризобиальных штаммов, ген pssB, кодирующий инозитолмонофосфатазу - у 21, ген rosR, ответственный за регуляцию транскрипции - у 31, гены prsD и prsE, отвечающие за секрецию белка NodO - у 20 и 21 ризобиального штамма соответственно.
Теоретическая значимость и практическая ценность полученных
результатов
Проведенное исследование показывает оценку степени важности генетического контроля биосинтеза ЭПС в процессе образования ризобиальных биопленок. Поскольку, ЭПС играют решающую роль в прикрепление бактерий к поверхностям, в установлении симбиотических отношений с бобовыми растениями, в питании и защите от вредных факторов окружающей среды. В данной работе было показано, как наличие генов ЭПС влияет на образование биопленок.
В рамках исследования, был проведен скрининг 99 штаммов R. leguminosarum из коллекции ИБГ УНЦ РАН на предмет наличия у них генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, регулирующих биосинтез ЭПС. В результате скрининга был выявлен 1 штамм ризобий, содержащий все исследуемые гены и 23 штамма, у которых не было обнаружено ни одного из представленных генов. Такие штаммы характеризовались скудным ослизнением клеток, по сравнению с другими штаммами. Данное исследование показало, как наличие генов, ответственных за синтез ЭПС, влияет на образование ризобиальных биопленок.
Полученные результаты раскрывают функциональную особенность каждого из исследуемых генов, участвующих в биосинтезе ЭПС в процессах, связанных с образованием ризобактериями биопленок, показывают их роль в установлении симбиотических отношений и выживании ризобактерий в естественных условиях ризосферы. Чем больше ризобии синтезируют ЭПС, тем выше их конкурентоспособность по сравнению с другими штаммами
В медицинской практике формирование биопленок создаёт большую проблему из-за трудностей борьбы с ними. Так, методы идентификации и изучение генов, которые участвуют в образовании патогенных биопленок в организме человека, позволяют найти способ борьбы с биопленками, путём регулирования этих генов, что приведет к тому, что бактерии окажутся неспособны образовывать биопленки.
Проведенное нами исследование, свидетельствуют о существенной роли изучения генетической регуляции ЭПС не только у ризобиальных биопленок, но и у биопленок, образованными патогенными бактериями в организме человека.
1. Проведен сравнительный анализ последовательностей генов pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, зарегистрированных в GenBank.
2. Произведен подбор специфичных праймеров к генам pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, регулирующих биосинтез экзополисахаридов у бактерий Rhizobium leguminosarum.
3. С помощью ионообменной смолы Chelex были выделены ДНК из 99 штаммов R. leguminosarum.
4. Методом полимеразной цепной реакции были амплифицированы гены pssA, pssB, prsD, prsE и rosR.
5. Проведено секвенирование, полученных при амплификации генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE, последовательностей ДНК и их сравнение с последовательностями, представленными в GenBank.
6. Проведен скрининг штаммов Rhizobium leguminosarum на наличие генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE. В результате проведенного скрининга из 99 штаммов Rhizobium leguminosarum был выявлен лишь 1 штамм ризобий, содержащий все исследуемые гены. Ген pssA был идентифицирован у 26 ризобиальных штаммов, ген pssB - у 21, ген rosR - у 31, ген prsD - у 20 и ген prsE у 21 ризобиального штамма.
2. Произведен подбор специфичных праймеров к генам pssA, pssB, prsD, prsE и rosR, регулирующих биосинтез экзополисахаридов у бактерий Rhizobium leguminosarum.
3. С помощью ионообменной смолы Chelex были выделены ДНК из 99 штаммов R. leguminosarum.
4. Методом полимеразной цепной реакции были амплифицированы гены pssA, pssB, prsD, prsE и rosR.
5. Проведено секвенирование, полученных при амплификации генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE, последовательностей ДНК и их сравнение с последовательностями, представленными в GenBank.
6. Проведен скрининг штаммов Rhizobium leguminosarum на наличие генов pssA, pssB, rosR, prsD, prsE. В результате проведенного скрининга из 99 штаммов Rhizobium leguminosarum был выявлен лишь 1 штамм ризобий, содержащий все исследуемые гены. Ген pssA был идентифицирован у 26 ризобиальных штаммов, ген pssB - у 21, ген rosR - у 31, ген prsD - у 20 и ген prsE у 21 ризобиального штамма.
