ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Фенотипические методы типирования штаммов 8
1.2. Методы генотипирования 10
1.3. Пробиотики 22
1.4. Лакто- и бифидобактерии 23
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1. Выделение препаратов ДНК микроорганизмов из клинического
материала методом нуклеосорбции 28
2.2. Выделение препаратов ДНК микроорганизмов из клинического
материала методом с использованием смолы Chelex 31
2.3. Выделение препаратов ДНК микроорганизмом фенол-хлорофорным
методом 32
2.4. Подбор праймеров 33
2.5. КАРИ-анализ 34
2.6. Электрофорез 36
2.7. Компьютерный анализ 37
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 38
ВЫВОДЫ 47
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 48
Актуальность темы.
Дифференциация штаммов и видов микроорганизмов - актуальная задача микробиологии и эпидемиологии. Методы идентификации бактерий, основанные на фенотипических признаках, ПЦР, фрагмент- анализе в большинстве случаев не характеризуются высоким значением коэффициента дифференциации, воспроизводимостью, требуют применения в каждом эксперименте референсных штаммов. Генотипирование на основе секвенирования фрагментов генома микроорганизмов свободно от указанных недостатков, что открывает более широкие возможности в идентификации штаммов.
В последние годы среди используемых методов типирования главенствующее место стали занимать молекулярно-биологические подходы.
Видами внутривидового типирования являются биотипирование, фаготипирование, резистотипирование, серотипирование и
генотипирование.
Биотипирование основывается на том, что для микроорганизмов характерна определенная вариабельность в ферментации отдельных углеводов, многоатомных спиртов, определенных аминокислот и др.
Фаготипирование - это методика определения источников заражения при мониторинге окружающей среды. Суть ее заключается в маркировке инфекционных штаммов бактерий при помощи бактериофагов. Другими словами, фаготипирование необходимо для идентификации штаммов бактерий, вызвавших тот или иной всплеск инфекционных заболеваний.
Этот метод используется для внутривидовой идентификации штаммов бактерий (для определения фаготипа бактерии - фаговара). Когда человек подвергается инфицированию определенной бактерией, которую высеяли при проведении бактериологических исследований, чтобы назначить эффективное лечение, необходимо знать, конкретно который из штаммов этой бактерии (ее разновидность) присутствует в организме человека. Например, существует много разновидностей стафилококка, к которым трудно подобрать антибиотик, не зная точно их фаготипа. Таким же разнообразием фаговаров «страдают» и бактерии рода Shigella flexneri, Salmonella, энтеропатогенная Escherichia coli и множество других бактерий.
Фаготипирование используют в случаях назначения лечения бактериофагами для эффективности их применения. Бактериологический анализ выявляет присутствие в организме конкретного вида бактерии, а с помощью фаготипирования определяют, подходит ли выбранный для лечения препарат бактериофага к данному бактериальному штамму, будет ли осуществлен лизис патогенной бактерии.
В качестве одного из методов фенотипического маркирования может использоваться и чувствительность к антибиотикам. В этом случае своеобразным маркером может служить спектр антибиотиков, к действию которых устойчив изучаемый штамм. Обычно у эпидемиологически связанных штаммов спектры резистентности оказываются идентичными. Следует помнить, что в отдельных случаях такие штаммы могут отличаться по 1-2 антибиотикам, входящим в спектр резистентности. Широкое распространение множественной лекарственной устойчивости, связанной с наличием определенных R-плазмид (утрата или приобретение), может определять некоторые отличия спектров резистентности у эпидемиологически родственных штаммов.
Метод серотипирования бактерий при исследовании микробной взвеси или обогащенного бульона основан на визуальном определении наличия агглютинации, цвет которой соответствует конкретной серологической группе бактерий. В бактериологических лабораториях наиболее широкое применение получили два метода: классический метод пробирочной реакции агглютинации и метод иммобилизации в полужидком агаре. Первый из них сопряжен с необходимостью многократного пассирования исследуемых штаммов и потому длителен во времени - занимает до недели и более, а важнейшим недостатком второго является большой расход диагностических препаратов и трудоемкость приготовления в стерильных условиях полужидкого агара с сыворотками и розлива его в большое количество пробирок. Рекомендуемый способ серотипирования посредством реакции агглютинации на стекле является простым, легко доступным для выполнения в бактериологических лабораториях любой категории, обеспечивает, по сравнению с классическим, значительное сокращение срока получения результата, а по сравнению с методом иммобилизации в полужидком агаре - 10-15-
кратную экономию диагностических сывороток.
Генотипирование микроорганизмов - основное методическое направление современной молекулярной эпидемиологии. Существуют методы: полного и лимитированного сиквенса генов, анализ
полиморфизма длин фрагментов рестрикции ДНК, сполиготипирование, VNTR-типирование, резистотипирование и др.
Целью работы явилась сравнительная оценка информативности нескольких методов генотипирования для дифференцирования лакто- и бифидобактерий.
Задачи исследования:
1. Подобрать видоспецифичные праймеры к консервативным генам видов лакто- и бифидобактерий для их внутривидового дифференцирования.
2. Оценить специфичность подобранных праймеров на контрольных образцах.
3. Оценить возможность применения методов молекулярного фингерпринтирования для выявления генетических различий между штаммами пробиотических микроорганизмов.
1. С помощью сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК лакто- и бифидобактерий были выявлены вариабельные участки для подбора к ним видоспецифичных праймеров.
2. Полученные праймеры являются видоспецифичными и могут использоваться для оценки генетической идентичности культур лакто- и бифидобактерий.
3. Для оценки генетической идентичности культур лакто- и бифидобактерий могут использоваться BOX-ПЦР, ERIC-ПЦР и RAPD, однако более информативным является метод случайной амплификации полиморфных фрагментов ДНК (RAPD).
