ИССЛЕДОВАНИЕ ВИДОВОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГРИБНОГО СИМБИОНТА ЭКТОМИКОРИЗ ХВОЙНЫХ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ МЕТОДОМ ДНК-МЕТАБАРКОДИНГА
|
АННОТАЦИЯ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. Аналитический обзор 8
1.1 Микориза как особый тип эукариотического симбиоза высших растений и грибов 8
1.1.1 Концепция социальной сети 10
1.2 Типы микориз 11
1.3 Строение и формирование эктомикоризных корневых окончаний 13
1.3.1 Морфотипы эктомикоризных корневых окончаний 15
1.4 Грибы, образующие эктомикоризу 16
1.5 Функциональное значение эктомикориз 17
1.6 Облигатная микотрофность основных лесообразующих пород и методы ее
изучения 20
1.7 Микотрофность лесообразующих пород в лесных экосистемах Западной Сибири на
примере Pinus sibirica Du Tour 22
2. Материалы и методы исследования 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Глубинное культивирование макромицетов 29
2.2.1 Приготовление питательных сред 29
2.2.2 Пассаж грибных культур 30
2.2.3 Микрометод определения редуцирующих сахаров 31
2.2.4 Определение содержания водорастворимого белка 32
2.3 Изоляция и культивирование грибов-симбионтов из эктомикоризы древесных
пород 33
2.4 Идентификация грибного симбионта методом ДНК-метабаркодинга 35
2.4.1 Определение и метод 35
2.4.2 Методика работы с редактором множественного выравнивания нуклеотидных и
аминокислотных последовательностей BioEdit 37
3. Результаты и обсуждение 41
3.1 Анализ роста микоризованных сеянцев Pinus sibirica и Pinus sylvestris с закрытой
корневой системой 41
3.2 Изменение содержания глюкозы и водорастворимого белка при глубинном
культивировании 42
3.3 Идентификация грибного симбионта сосняков и кедровников Томской области
методом ДНК-метабаркодинга 44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 55
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 56
ПРИЛОЖЕНИЕ А 61
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 62
ПРИЛОЖЕНИЕ В 63
ПРИЛОЖЕНИЕ Г 64
ПРИЛОЖЕНИЕ Д 66
ВВЕДЕНИЕ 5
1. Аналитический обзор 8
1.1 Микориза как особый тип эукариотического симбиоза высших растений и грибов 8
1.1.1 Концепция социальной сети 10
1.2 Типы микориз 11
1.3 Строение и формирование эктомикоризных корневых окончаний 13
1.3.1 Морфотипы эктомикоризных корневых окончаний 15
1.4 Грибы, образующие эктомикоризу 16
1.5 Функциональное значение эктомикориз 17
1.6 Облигатная микотрофность основных лесообразующих пород и методы ее
изучения 20
1.7 Микотрофность лесообразующих пород в лесных экосистемах Западной Сибири на
примере Pinus sibirica Du Tour 22
2. Материалы и методы исследования 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Глубинное культивирование макромицетов 29
2.2.1 Приготовление питательных сред 29
2.2.2 Пассаж грибных культур 30
2.2.3 Микрометод определения редуцирующих сахаров 31
2.2.4 Определение содержания водорастворимого белка 32
2.3 Изоляция и культивирование грибов-симбионтов из эктомикоризы древесных
пород 33
2.4 Идентификация грибного симбионта методом ДНК-метабаркодинга 35
2.4.1 Определение и метод 35
2.4.2 Методика работы с редактором множественного выравнивания нуклеотидных и
аминокислотных последовательностей BioEdit 37
3. Результаты и обсуждение 41
3.1 Анализ роста микоризованных сеянцев Pinus sibirica и Pinus sylvestris с закрытой
корневой системой 41
3.2 Изменение содержания глюкозы и водорастворимого белка при глубинном
культивировании 42
3.3 Идентификация грибного симбионта сосняков и кедровников Томской области
методом ДНК-метабаркодинга 44
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 55
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 56
ПРИЛОЖЕНИЕ А 61
ПРИЛОЖЕНИЕ Б 62
ПРИЛОЖЕНИЕ В 63
ПРИЛОЖЕНИЕ Г 64
ПРИЛОЖЕНИЕ Д 66
Западная Сибирь является исключительно важным регионом для российской экономики. Здесь находятся крупнейшие в стране нефтегазоносные провинции, самые плодородные в Сибири земли, важные центры металлургической и химической промышленности.
Бореальные леса представляют собой второй крупнейший биом в мире, составляющий 33% от общей лесной поверхности, из которой естественными являются примерно 25% [44]. Бореальные леса Западной Сибири - одна из крупнейших непрерывных экосистем Земли, неотъемлемый важнейший компонент биосферы. Их вклад в поддержание устойчивости экологической системы планеты чрезвычайно велик: это и участие в глобальных циклах основных биогенных элементов, и снижение парникового эффекта за счет стока углекислого газа, и реализация планетарной функции процесса фотосинтеза. Леса имеют важное экологическое и социальное значение, благотворно влияют на климат и погоду, водный баланс и водное хозяйство, здоровье человека [32, 42].
В последнее время наблюдаются неблагоприятные тенденции в изменении состояния Бореальных лесов. Интенсивная эксплуатация хвойных лесов ухудшила возрастную структуру лесного фонда, сократила площади, занимаемые ценными сосновыми, кедровыми и еловыми лесами, вызвала снижение внутривидового разнообразия, исчезновение ценных генотипов. Лесной фонд России также истощается в результате поражения вредителями и пожарами. Анализ состояния лесных ресурсов в Западной и Восточной Сибири показал: смену пород, частые вспышки инфекционных заболеваний, исчезновение наиболее продуктивных древостоев, происходящее к увеличению доли искусственных лесонасаждений, массовое усыхание отдельных видов хвойных [7].
Для нормального развития любого вида дерева необходимы специализированные штаммы грибов-макромицетов, образующих эктомикоризу - орган, возникший из поглощающего корня в результате заселения эктомикоризным грибом, прикрепляющимся к проводящему корню в одном месте. Известно, что эктомикоризу образуют 8000 видов высших растений и около 10000 видов грибов планеты [51]. Обязательная микотрофность хвойных как основных лесообразующих пород фитоценозов бореальной зоны обусловлена активным участием эктомикоризных грибов в круговороте биогенных элементов, например, углерода, а также в процессах оптимизации метаболизма растений и другими их свойствами [25, 41].
В дополнении к взаимодействию мицелия эктомикориз с корнями их растения -хозяина происходит так же взаимодействие с рядом органических и неорганических субстратов, а так же с различными организмами, такими как бактерии, другие грибы, почвенная микро- и мезофауна и корни вторичных растений-хозяев [28].
Микориза, как симбиотическая ассоциация мицелия гриба и корня, образуется у 82% видов наземных и некоторых водных растений. В микоризообразовании у древесных на Севере участвует более 400 видов грибов. Симбиоз с грибами и их коэволюция способствует выживанию хвойных растений в условиях холодного климата. Исследования функциональной экологии эктомикориз и связанных с ними бактерий потенциально могут дать основу для управления воздействием изменения климата на леса. Большое внимание уделяется изучению экологической роли микоризных ассоциаций в биогеоценозах [22, 30].
Изучение экологии и физиологии эктомикориз сосредоточено в основном в Европе, Северной Америке и Австралии. В России различными аспектами эктомикориз занимались многие исследователи, тем не менее микотрофность не только сосны сибирской, но и всех лесных пород Западной Сибири, остается совершенно неизученным вопросом.
Проблема в том, что в почве нарушенных лесов исчезает подземная грибная сеть, взамен там поселяются грибы, которые не приносят растениям пользы. Научившись выделять и выращивать в культуре нужный грибной компонент, появится возможность остановить неблагоприятные тенденции в изменении состояния Бореальных лесов [56].
Объект исследования: эктомикориза.
Предмет: макромицеты лесных биоценозов Томской области.
Цель данной работы заключается в получении практических навыков по сбору макромицетов в лесных биоценозах Томской области, их идентификация и культивирование in vitro.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Сбор плодовых тел эктомикоризообразующих макромицетов.
2. Идентификация микосимбионта путем анализа последовательности ДНК (ДНК- метабаркодинг).
3. Выделение чистых культур из плодовых тел макромицетов.
Защищаемые положения:
1. Микобиота сосняков и кедровников Томской области практически не изучена.
2. Выживаемость, рост и развитие микоризованных сеянцев в закрытой корневой системе выше, чем у немикоризованных.
3. Для трудноопределяемых видов необходимо использовать метод ДНК -
идентификации.
Во время обучения в Томском государственном университете материалы работы представлены на университетской конференции «Старт в науку». Подготовлена и принята к печати статья «First list of macromycetes forming ectomycorrhizas in cedar and pine forests of Tomsk region of West Siberia» для международного журнала International Journal of Environmental Studies.
Практическая часть работы была выполнена на инновационном предприятии ООО «Микобакс» при Томском государственном университете под руководством кандидата биологических наук, доцента О.Б. Вайшля и инжинера-микробиолога Н.В. Шабалиной.
Автор работы выражает благодарность своему научному руководителю О.Б. Вайшля и инженеру-микробиологу ООО «Микобакс» Н.В. Шабалиной за помощь в освоении методов культивирования макромицетов; за помощь в освоении метода ДНК-идентификации аспиранту кафедры зоологии позвоночных и экологии К. C. Карбышевой; за помощь в определении систематической принадлежности макромицетов - старшему научному сотруднику НИИББ ТГУ Н.Н. Кудашовой.
Бореальные леса представляют собой второй крупнейший биом в мире, составляющий 33% от общей лесной поверхности, из которой естественными являются примерно 25% [44]. Бореальные леса Западной Сибири - одна из крупнейших непрерывных экосистем Земли, неотъемлемый важнейший компонент биосферы. Их вклад в поддержание устойчивости экологической системы планеты чрезвычайно велик: это и участие в глобальных циклах основных биогенных элементов, и снижение парникового эффекта за счет стока углекислого газа, и реализация планетарной функции процесса фотосинтеза. Леса имеют важное экологическое и социальное значение, благотворно влияют на климат и погоду, водный баланс и водное хозяйство, здоровье человека [32, 42].
В последнее время наблюдаются неблагоприятные тенденции в изменении состояния Бореальных лесов. Интенсивная эксплуатация хвойных лесов ухудшила возрастную структуру лесного фонда, сократила площади, занимаемые ценными сосновыми, кедровыми и еловыми лесами, вызвала снижение внутривидового разнообразия, исчезновение ценных генотипов. Лесной фонд России также истощается в результате поражения вредителями и пожарами. Анализ состояния лесных ресурсов в Западной и Восточной Сибири показал: смену пород, частые вспышки инфекционных заболеваний, исчезновение наиболее продуктивных древостоев, происходящее к увеличению доли искусственных лесонасаждений, массовое усыхание отдельных видов хвойных [7].
Для нормального развития любого вида дерева необходимы специализированные штаммы грибов-макромицетов, образующих эктомикоризу - орган, возникший из поглощающего корня в результате заселения эктомикоризным грибом, прикрепляющимся к проводящему корню в одном месте. Известно, что эктомикоризу образуют 8000 видов высших растений и около 10000 видов грибов планеты [51]. Обязательная микотрофность хвойных как основных лесообразующих пород фитоценозов бореальной зоны обусловлена активным участием эктомикоризных грибов в круговороте биогенных элементов, например, углерода, а также в процессах оптимизации метаболизма растений и другими их свойствами [25, 41].
В дополнении к взаимодействию мицелия эктомикориз с корнями их растения -хозяина происходит так же взаимодействие с рядом органических и неорганических субстратов, а так же с различными организмами, такими как бактерии, другие грибы, почвенная микро- и мезофауна и корни вторичных растений-хозяев [28].
Микориза, как симбиотическая ассоциация мицелия гриба и корня, образуется у 82% видов наземных и некоторых водных растений. В микоризообразовании у древесных на Севере участвует более 400 видов грибов. Симбиоз с грибами и их коэволюция способствует выживанию хвойных растений в условиях холодного климата. Исследования функциональной экологии эктомикориз и связанных с ними бактерий потенциально могут дать основу для управления воздействием изменения климата на леса. Большое внимание уделяется изучению экологической роли микоризных ассоциаций в биогеоценозах [22, 30].
Изучение экологии и физиологии эктомикориз сосредоточено в основном в Европе, Северной Америке и Австралии. В России различными аспектами эктомикориз занимались многие исследователи, тем не менее микотрофность не только сосны сибирской, но и всех лесных пород Западной Сибири, остается совершенно неизученным вопросом.
Проблема в том, что в почве нарушенных лесов исчезает подземная грибная сеть, взамен там поселяются грибы, которые не приносят растениям пользы. Научившись выделять и выращивать в культуре нужный грибной компонент, появится возможность остановить неблагоприятные тенденции в изменении состояния Бореальных лесов [56].
Объект исследования: эктомикориза.
Предмет: макромицеты лесных биоценозов Томской области.
Цель данной работы заключается в получении практических навыков по сбору макромицетов в лесных биоценозах Томской области, их идентификация и культивирование in vitro.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Сбор плодовых тел эктомикоризообразующих макромицетов.
2. Идентификация микосимбионта путем анализа последовательности ДНК (ДНК- метабаркодинг).
3. Выделение чистых культур из плодовых тел макромицетов.
Защищаемые положения:
1. Микобиота сосняков и кедровников Томской области практически не изучена.
2. Выживаемость, рост и развитие микоризованных сеянцев в закрытой корневой системе выше, чем у немикоризованных.
3. Для трудноопределяемых видов необходимо использовать метод ДНК -
идентификации.
Во время обучения в Томском государственном университете материалы работы представлены на университетской конференции «Старт в науку». Подготовлена и принята к печати статья «First list of macromycetes forming ectomycorrhizas in cedar and pine forests of Tomsk region of West Siberia» для международного журнала International Journal of Environmental Studies.
Практическая часть работы была выполнена на инновационном предприятии ООО «Микобакс» при Томском государственном университете под руководством кандидата биологических наук, доцента О.Б. Вайшля и инжинера-микробиолога Н.В. Шабалиной.
Автор работы выражает благодарность своему научному руководителю О.Б. Вайшля и инженеру-микробиологу ООО «Микобакс» Н.В. Шабалиной за помощь в освоении методов культивирования макромицетов; за помощь в освоении метода ДНК-идентификации аспиранту кафедры зоологии позвоночных и экологии К. C. Карбышевой; за помощь в определении систематической принадлежности макромицетов - старшему научному сотруднику НИИББ ТГУ Н.Н. Кудашовой.
Анализ литературных данных показал, что взаимоотношениям микоризообразующих грибов и древесных растений, роли эктомикоризы в продуктивности и устойчивости лесных экосистем Западной Сибири уделяется незаслуженно мало внимания. Томская область в этом отношении является практически неизученной территорией.
В лесных биогеоценозах эктомикоризы играют фундаментальную роль, поскольку ее самые разнообразные морфотипы встречаются на корнях доминирующих в бореальных лесах древесных пород именно в экстремальных условиях местообитания. Присутствие на корнях сеянцев и саженцев деревьев эктомикоризы и степень ее развития является существенным показателем их качества, поскольку растения с развитой микоризой лучше приживаются и растут, особенно на бедных почвах.
Эктомикориза по определению - малоспецифичный симбиоз, однако род Pinus является гетерогенным в отношении видов грибных симбионтов: грибы рода Cortinarius, Rhodocollybia, Conocybe, Galerina, Rickenella, Strobilurus и Arrhenia доминируют в сосняках. В кедраче чаще встречаются Inocybe, Laccaria, Hemimycena. Russula, Lactarius, Amanita, Tricholoma одинаково микоризуют и Pinus sibirica, и Pinus sylvestris.
По результатам проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Исследования видового разнообразия макромицетов лесных биоценозов Томской области показали, что микобиота Томской области практически не изучена. ДНК- метабаркодинг, как наиболее точный метод, позволяет установить таксономическую принадлежность трудноопределяемых видов. Из 282 наименований в сформированном списке эктомикоризников Томской области: 58 видов впервые обнаружены в нашем регионе. Так же 15 видов, которые ранее не были идентифицированы для территории Западной Сибири и 2 - впервые зарегистрированы на территории России.
2. Микоризация Pinus sibirica оказала непосредственное влияние на рост, развитие и выживаемость сеянцев в условиях закрытого грунта. Индекс микоризации у сеянцев Pinus sibirica оказался максимальным при внесении препарата со штаммом 536 Suillus sibirica с азотфиксирующими бактериями.
3. Проведено редактирование примерно 50 сиквенсов макромицетов. Определена их таксономическая принадлежность путем сравнения референтных последовательностей в базе данных NCBI.
В лесных биогеоценозах эктомикоризы играют фундаментальную роль, поскольку ее самые разнообразные морфотипы встречаются на корнях доминирующих в бореальных лесах древесных пород именно в экстремальных условиях местообитания. Присутствие на корнях сеянцев и саженцев деревьев эктомикоризы и степень ее развития является существенным показателем их качества, поскольку растения с развитой микоризой лучше приживаются и растут, особенно на бедных почвах.
Эктомикориза по определению - малоспецифичный симбиоз, однако род Pinus является гетерогенным в отношении видов грибных симбионтов: грибы рода Cortinarius, Rhodocollybia, Conocybe, Galerina, Rickenella, Strobilurus и Arrhenia доминируют в сосняках. В кедраче чаще встречаются Inocybe, Laccaria, Hemimycena. Russula, Lactarius, Amanita, Tricholoma одинаково микоризуют и Pinus sibirica, и Pinus sylvestris.
По результатам проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Исследования видового разнообразия макромицетов лесных биоценозов Томской области показали, что микобиота Томской области практически не изучена. ДНК- метабаркодинг, как наиболее точный метод, позволяет установить таксономическую принадлежность трудноопределяемых видов. Из 282 наименований в сформированном списке эктомикоризников Томской области: 58 видов впервые обнаружены в нашем регионе. Так же 15 видов, которые ранее не были идентифицированы для территории Западной Сибири и 2 - впервые зарегистрированы на территории России.
2. Микоризация Pinus sibirica оказала непосредственное влияние на рост, развитие и выживаемость сеянцев в условиях закрытого грунта. Индекс микоризации у сеянцев Pinus sibirica оказался максимальным при внесении препарата со штаммом 536 Suillus sibirica с азотфиксирующими бактериями.
3. Проведено редактирование примерно 50 сиквенсов макромицетов. Определена их таксономическая принадлежность путем сравнения референтных последовательностей в базе данных NCBI.
