СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 2
ВВЕДЕНИЕ 5
1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Проблемы нефтезагрязнения окружающей среды 7
1.2 Состав нефти 10
1.3 Транспорт субстратов в клетки микроорганизмов 11
1.4 Описание углеводородокисляющей микрофлоры 12
1.5 Типичные представители углеводородокисляющей микрофлоры 14
1.5.1 Род Bacillus 15
1.5.2 Род Micrococcus 16
1.5.3 Род Rhodococcus 17
1.5.4 Род Pseudomonas 19
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1 Объекты исследования 22
2.1.1 Биопрепарат «Дестройл» 22
2.1.2 Нефть Усинского нефтяного месторождения 22
2.2 Методы исследования 23
2.2.1 Учет численности гетеротрофной микрофлоры на мясо-пептоном агаре
(МПА) 23
2.2.2 Метод разведения и высева на плотные агаровые среды (метод Коха)...23
2.2.3 Метод окраски по Граму 25
2.2.4 Методика определения активности каталазы 25
2.2.5 Методика определения дегидрогеназной активности 27
2.2.6 Методы экстракции органического вещества на аппарате Сокслета из
твердой субстанции (почва) 28
2.2.7 Экстракция органического вещества хлороформом из жидкой среды.. .29
2.2.8 Моделирование процессов биодеструкции нефти в водной среде 30
2.2.9 Метод ИК-спектрального анализа органического вещества нефти 31
2.2.10 Моделирование процессов биодеструкции нефти в почве 31
2.2.11 Определение содержания нефти в почве 32
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 33
3.1 Изучение микробного состава биопрепарата «Дестройл» 33
3.2 Биодеструкция нефти в водной фазе с использованием микроорганизмов,
выделенных из биопрепарата «Дестройл» 36
3.2.1 Сравнительный ИК-спектрометрический анализ углеводородов нефти, до и
после биодеструкции в водной фазе 40
3.3 Биодеструкция нефти в почве с использованием микроорганизмов, выделенных
из биопрепарата «Дестройл» 43
ВЫВОДЫ 51
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 52
ПРИЛОЖЕНИЕ 56
В настоящее время, в связи с развитием нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности общая площадь загрязнения грунтов и водных экосистем непрерывно растет. Особому риску подвержены территории и акватории в регионах, где расположены нефтегазодобывающие комплексы. Для очистки нефтезагрязненных экосистем в зависимости от концентрации загрязнения используют механические, термические, физико-химические и комплексные методы. Альтернативой этим методам служит биремедиация - использование микроорганизмов- нефтедеструкторов для восстановления нефтезагрязненных территорий.
Микробиологический способ биоремедиации загрязненных нефтью почв является экономически выгодным и экологически безопасным. Пористость и насыщенность почв минеральными и органическими остатками создают условия для подвижности и жизнедеятельности микроорганизмов.
Изучение роста и деструктивной активности бактериальных популяций в условиях нефтезагрязненных почв имеет важное значение для разработки микробиологических методов биоремедиации. В основе биотехнологий, направленных на улучшение экологии, лежит способность к окислению углеводородов. Микроорганизмы - единственные живые существа, способные использовать углеводороды как источник энергии. Существуют два подхода для биоремедиации почв, загрязненных нефтью: первый - стимуляция процессов деструкции путем внесения питательных субстратов, повышающих активность естественной микрофлоры в процессах биодеструкции углеводородов нефти и второй - применение специальных биопрепаратов, содержащих активную микрофлору.
Биоремедиация может быть основана на стимуляции аборигенной микрофлоры, однако, в зоне экстремальных условий, где жизнедеятельность микроорганизмов подавляется стрессовыми факторами среды (низкая температура, обедненная почва, высокая концентрация нефтезагрязнения и др.) необходимо внесение биопрепаратов. В состав биопрепаратов обычно включают ассоциацию культур разных родов с высокой деструктивной (оксигеназной) активностью по отношению к углеводородам нефтяного ряда. Ключевым фактором для проявления активности роста и деструкции является температура. Поэтому для ремедиации в холодном климате применяют биопрепараты содержащие культуры, толерантные к низкой температуре, в умеренном - мезофилы.
В лабораторных условиях изучено влияние коммерческого биопрепарата «Дестройл», добавленного в загрязненную почву на процессы биодеструкции углеводородов нефти, применены методы фиторемедиации, в водной среде, загрязненной нефтью, изучена ферментативная окислительная активность отдельных штаммов- компонентов биопрепарата.
Цель данной работы является: оценка возможности ускорения деструкции углеводородов нефти, загрязняющих водную и почвенную фазу, путем применения микроорганизмов, выделенных из биопрепарата «Дестройл», с последующим созданием архива выделенных культур.
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:
1) Исследовать динамику численности микроорганизмов в чистых культурах в процессе биодеструкции нефти;
2) Оценить ферментативную активность микроорганизмов в зависимости от их численности;
3) Определить эффективность биодеструкции нефти в почве и воде.
1) Исследована деструктивная активность бипрепарата «Дестройл», внесенного в нефтезагрязненную почву в концентрации 0.1 и 0.4 г/кг. Утилизация нефти за 30 суток составила 60% и 80% соответственно. В контрольном варианте, деструкция нефти за счет естественной микрофлоры составила 28 %
2) В процессе биодеструкции максимальная каталазная и дегидрогеназная ферментативная активность почвы с добавлением 0.1 г биопрепарата составила 8.2 и 0.4, в контрольной почве 7.3 и 0.24 соответственно.
3) В процессе скрининга на способность использовать нефть в качестве энергетического субстрата из состава биопрепарата отобраны изоляты, принадлежавшие к родам: Bacillus sp (1а), Micrococcus sp (2а), Rhodococcus sp (4а), Pseudomonas sp (10). Активность изолированных культур
4) При деструкции углеводородов нефти выделенными изолятами в жидкой фазе максимальная каталазная активность определена в интервале 2.9 - 3.6.
5) ИК-спектрометрический анализ нефтей после биодеградации подтвердил деструктивную активность биопрепарата и выделенных чистых культур в водной среде и почве.
