РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЕТЕКЦИИ ДЕЛЕЦИИ 14 ЭКЗОНА ГЕНА МЕТ
|
АННОТАЦИЯ 2
Список сокращений 3
Введение 4
1 Обзор литературы 6
1.1 Факторы риска развития рака легкого 6
1.2 Патоморфологическая характеристика немелкоклеточного рака легкого 10
1.3 Таргетная терапия 11
1.4 Протоонкоген MET 15
1.5 Основные сигнальные пути, опосредованные тирозинкиназой рецептора MET 17
1.6 Мутации гена MET 18
1.7 Методы детекции делеции 14 экзона гена МЕТ 20
2 Материалы и методы 22
2.1 Материал исследования 22
2.2 Методы 22
1.2.1 Конструирование праймеров 22
2.2.2 Выделение ДНК из фиксированной формалином и залитой парафином ткани
легкого 22
2.2.3 Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК 23
2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени гена EGFR .24
2.2.5 Подбор условий ПЦР для получения ампликонов 14 экзона гена MET с
использованием градиента температур 25
2.2.6 Качественный анализ ДНК 25
2.2.7 Очистка ПЦР-продукта с помощью полиэтиленгликоля 25
2.2.8 Проведение секвенирующей реакции 26
2.2.9 Очистка продуктов секвенирующей реакции с помощью Sephadex G-50 26
2.2.10 Секвенирование по методу Сэнгера 26
2.2.11 Анализ полученных данных 27
3 Результаты и обсуждение 28
Список использованных источников и литературы 39
Список сокращений 3
Введение 4
1 Обзор литературы 6
1.1 Факторы риска развития рака легкого 6
1.2 Патоморфологическая характеристика немелкоклеточного рака легкого 10
1.3 Таргетная терапия 11
1.4 Протоонкоген MET 15
1.5 Основные сигнальные пути, опосредованные тирозинкиназой рецептора MET 17
1.6 Мутации гена MET 18
1.7 Методы детекции делеции 14 экзона гена МЕТ 20
2 Материалы и методы 22
2.1 Материал исследования 22
2.2 Методы 22
1.2.1 Конструирование праймеров 22
2.2.2 Выделение ДНК из фиксированной формалином и залитой парафином ткани
легкого 22
2.2.3 Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК 23
2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени гена EGFR .24
2.2.5 Подбор условий ПЦР для получения ампликонов 14 экзона гена MET с
использованием градиента температур 25
2.2.6 Качественный анализ ДНК 25
2.2.7 Очистка ПЦР-продукта с помощью полиэтиленгликоля 25
2.2.8 Проведение секвенирующей реакции 26
2.2.9 Очистка продуктов секвенирующей реакции с помощью Sephadex G-50 26
2.2.10 Секвенирование по методу Сэнгера 26
2.2.11 Анализ полученных данных 27
3 Результаты и обсуждение 28
Список использованных источников и литературы 39
Рак легкого - злокачественное образование, возникающее в эпителиальной ткани легкого под воздействием факторов риска, таких как курение, наследственная предрасположенность, неблагоприятные факторы окружающей среды [Pre-neoplastic and neoplastic changes ..., 2014]. На сегодняшний день рак легкого является одним из самых распространенных видов онкологических заболеваний в мире. Согласно данным на 2020 год рак легкого среди всех видов рака у мужчин занимает 1 место в структуре заболеваемости и структуре смертности, составляя 1,43 и 1,19 миллионов случаев соответственно, у женщин 2 место по структуре заболеваемости и структуре смертности, составляя 0,77 и 0,61 миллионов случаев соответственно [Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN ..., 2021].
Рак легкого по патоморфологическим характеристикам делят на два типа: немелкоклеточный и мелкоклеточный [Semenova et al., 2015]. Немелкоклеточный рак легкого включает 3 основных гистологических подтипа: аденокарциному,
плоскоклеточный и крупноклеточный рак. Гистологические типы рака различаются по характеру онкогенеза, клиническому течению и молекулярно-генетическим характеристикам, что получило отражение в различных вариантах лекарственной терапии [Davidson et al., 2013]. Немелкоклеточный рак в 70 % случаев выявляется на поздних стадиях заболевания, когда больные уже неоперабельны и лечение сводится к химиотерапии, при этом ответ на лечение и общая выживаемость невелики, медиана выживаемости составляет примерно 1 год при III или IV стадиях заболевания. В связи с этим актуальным является поиск мишеней и разработка более эффективных препаратов для лечения данного типа рака легкого [Genomic profiles specific ..., 2011].
С 2003 года идет интенсивная разработка противоопухолевых препаратов. Наиболее успешно развивается таргетная терапия, с появлением которой онкология продвинулась вперед от использования тестов для одного гена к множественному молекулярному тестированию. Мишенями персонализированной медицины являются биомаркеры (62 %) и рецепторы (31 %) [Falconi et al., 2014]. Одним из биомаркеров немелкоклеточного рака легкого являются мутации гена MET. Частота встречаемости делеции 14 экзона гена MET (METex14) составляет 3-4 % случаев данного типа рака. Среди других гистологических типов рака легкого делеция 14 экзона гена MET встречается в 1 % случаев
плоскоклеточного рака, в 2 % аденокарцином, в 6 % случаев аденосквамозной карциномы, в 13 % случаев саркаматоидного рака легкого. Распространенность делеции 14 экзона при саркоматоидных карциномах легкого может варьировать от 4,9 % до 31,8 % [Subramanian, Tawfik, 2021].
Ген MET (mesenchymal-epithelial transition factor) - протоонкоген, кодирующий тирозинкиназный белок. Ген вовлечен в сигнальные пути процессов эмбриогенеза, выживания, миграции и инвазии клеток. Делеция 14 экзона данного гена является неблагоприятным прогностическим фактором у пациентов. Ген МЕТ кодирует рецептор фактора роста гепатоцитов, который действует на клетки различных типов. При связывании лиганда рецептор претерпевает конформационные изменения, приводящие к активации его цитоплазматического домена и передаче сигнала вторичным мессенджерам, что направлено на стимуляцию пролиферации клеток [Subramanian, Tawfik, 2021].
Таргетная терапия - это терапия, направленная на подавление молекул, идентифицированных до этого как основные участники патогенеза опухолевых клеток [Моисеенко, 2010]. Новые лекарственные противоопухолевые препараты ежегодно изучаются в сотнях доклинических и клинических программ. Апробируются различные схемы, в которых таргетные препараты назначаются в монорежиме, в комбинациях друг с другом, в сочетании с химиопрепаратами. Использование таргетных препаратов позволяет улучшить клиническую эффективность лечения в целевых группах, а также снизить его себестоимость за счет отказа от заведомо неэффективных вмешательств. Для повышения эффективности таргетной терапии необходим поиск новых драйверных мишеней и создание препаратов, направленных против них, а также разработка мультитаргетного подхода [Проблемы и перспективы совершенствования ..., 2014].
Цель исследования: разработать метод определения делеции 14 экзона гена MET у пациентов с раком легкого в соответствии с клиническими рекомендациями.
Задачи:
1. Изучить статус мутации гена EGFR у пациентов с аденокарциномой легкого.
2. Оптимизировать метод поиска делеции 14 экзона гена MET с помощью секвенирования по методу Сэнгера.
3. Изучить статус мутации гена MET у пациентов с аденокарциномой легкого без мутаций гена EGFR.
1 Обзор литературы
1.1 Факторы риска развития рака легкого
Канцерогенез в бронхиальном эпителии - это многоэтапный процесс, происходящий под воздействием множества факторов, приводящих к изменению морфологии эпителия. Курение - один из главных факторов риска развития рака легкого. Проведенное клиническое исследование у пациентов с раком легкого показало, что риск его возникновения возрастал с увеличением продолжительности воздействия табачного дыма на эпителий легких. Это характерно для всех гистологических типов рака, но в большей степени для плоскоклеточного. Отмечено, что при прекращении курения риски значительно снижаются, в особенности для клеток бронхиального эпителия [Lubin, Blot, 1984].
Горение табака в сигаретах достигается при температуре 900 °С, это приводит к пиролизу, окислению, гидрогенизации, декарбоксилированию и дегидратации его компонентов. Было определено около 3000 химических веществ, входящих в состав табачного дыма. Обычно табачный дым преобладает в 2 фазах: в виде летучей или газообразной фазы; и в виде смолы или фазы частиц. Компоненты сигаретного дыма подразделяют на кислые, нейтральные и основные группы компонентов [Smoking and lung cancer: an overview, 1984].
Группа нейтральных компонентов содержит множество полиядерных ароматических углеводородов и проявляет большую часть канцерогенной активности, связанной с сигаретным дымом. К известным канцерогенам этой фракции относятся бензопирен и дибензантрацен, а также инсектициды на основе хлорированных углеводородов. Они вызывают как доброкачественные, так и злокачественные опухоли. Группа кислых компонентов содержит соединения, проявляющие коканцерогенную и опухолестимулирующую активность, а также ряд сильнодействующих мутагенов. Коканцерогены определяются как слабые канцерогены, которые усиливают активность других канцерогенов. К группе основных компонентов относятся никотин и W- нитрозонорникотин. Аналогичные соединения содержатся в кислой фракции табачной смолы [Van Duuren, 1973]. При сжигании табака из никотина и родственных ему алкалоидов образуется ряд канцерогенных нитрозаминов. Два из этих специфичных для табака нитрозаминов: W-нитрозонорникотин и 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон, являются исключительно сильными канцерогенами. Было высказано предположение, что высокая концентрация нитрозаминов в нюхательном табаке является причиной рака ротовой полости [Smoking and lung cancer: an overview, 1984].
Рак легкого по патоморфологическим характеристикам делят на два типа: немелкоклеточный и мелкоклеточный [Semenova et al., 2015]. Немелкоклеточный рак легкого включает 3 основных гистологических подтипа: аденокарциному,
плоскоклеточный и крупноклеточный рак. Гистологические типы рака различаются по характеру онкогенеза, клиническому течению и молекулярно-генетическим характеристикам, что получило отражение в различных вариантах лекарственной терапии [Davidson et al., 2013]. Немелкоклеточный рак в 70 % случаев выявляется на поздних стадиях заболевания, когда больные уже неоперабельны и лечение сводится к химиотерапии, при этом ответ на лечение и общая выживаемость невелики, медиана выживаемости составляет примерно 1 год при III или IV стадиях заболевания. В связи с этим актуальным является поиск мишеней и разработка более эффективных препаратов для лечения данного типа рака легкого [Genomic profiles specific ..., 2011].
С 2003 года идет интенсивная разработка противоопухолевых препаратов. Наиболее успешно развивается таргетная терапия, с появлением которой онкология продвинулась вперед от использования тестов для одного гена к множественному молекулярному тестированию. Мишенями персонализированной медицины являются биомаркеры (62 %) и рецепторы (31 %) [Falconi et al., 2014]. Одним из биомаркеров немелкоклеточного рака легкого являются мутации гена MET. Частота встречаемости делеции 14 экзона гена MET (METex14) составляет 3-4 % случаев данного типа рака. Среди других гистологических типов рака легкого делеция 14 экзона гена MET встречается в 1 % случаев
плоскоклеточного рака, в 2 % аденокарцином, в 6 % случаев аденосквамозной карциномы, в 13 % случаев саркаматоидного рака легкого. Распространенность делеции 14 экзона при саркоматоидных карциномах легкого может варьировать от 4,9 % до 31,8 % [Subramanian, Tawfik, 2021].
Ген MET (mesenchymal-epithelial transition factor) - протоонкоген, кодирующий тирозинкиназный белок. Ген вовлечен в сигнальные пути процессов эмбриогенеза, выживания, миграции и инвазии клеток. Делеция 14 экзона данного гена является неблагоприятным прогностическим фактором у пациентов. Ген МЕТ кодирует рецептор фактора роста гепатоцитов, который действует на клетки различных типов. При связывании лиганда рецептор претерпевает конформационные изменения, приводящие к активации его цитоплазматического домена и передаче сигнала вторичным мессенджерам, что направлено на стимуляцию пролиферации клеток [Subramanian, Tawfik, 2021].
Таргетная терапия - это терапия, направленная на подавление молекул, идентифицированных до этого как основные участники патогенеза опухолевых клеток [Моисеенко, 2010]. Новые лекарственные противоопухолевые препараты ежегодно изучаются в сотнях доклинических и клинических программ. Апробируются различные схемы, в которых таргетные препараты назначаются в монорежиме, в комбинациях друг с другом, в сочетании с химиопрепаратами. Использование таргетных препаратов позволяет улучшить клиническую эффективность лечения в целевых группах, а также снизить его себестоимость за счет отказа от заведомо неэффективных вмешательств. Для повышения эффективности таргетной терапии необходим поиск новых драйверных мишеней и создание препаратов, направленных против них, а также разработка мультитаргетного подхода [Проблемы и перспективы совершенствования ..., 2014].
Цель исследования: разработать метод определения делеции 14 экзона гена MET у пациентов с раком легкого в соответствии с клиническими рекомендациями.
Задачи:
1. Изучить статус мутации гена EGFR у пациентов с аденокарциномой легкого.
2. Оптимизировать метод поиска делеции 14 экзона гена MET с помощью секвенирования по методу Сэнгера.
3. Изучить статус мутации гена MET у пациентов с аденокарциномой легкого без мутаций гена EGFR.
1 Обзор литературы
1.1 Факторы риска развития рака легкого
Канцерогенез в бронхиальном эпителии - это многоэтапный процесс, происходящий под воздействием множества факторов, приводящих к изменению морфологии эпителия. Курение - один из главных факторов риска развития рака легкого. Проведенное клиническое исследование у пациентов с раком легкого показало, что риск его возникновения возрастал с увеличением продолжительности воздействия табачного дыма на эпителий легких. Это характерно для всех гистологических типов рака, но в большей степени для плоскоклеточного. Отмечено, что при прекращении курения риски значительно снижаются, в особенности для клеток бронхиального эпителия [Lubin, Blot, 1984].
Горение табака в сигаретах достигается при температуре 900 °С, это приводит к пиролизу, окислению, гидрогенизации, декарбоксилированию и дегидратации его компонентов. Было определено около 3000 химических веществ, входящих в состав табачного дыма. Обычно табачный дым преобладает в 2 фазах: в виде летучей или газообразной фазы; и в виде смолы или фазы частиц. Компоненты сигаретного дыма подразделяют на кислые, нейтральные и основные группы компонентов [Smoking and lung cancer: an overview, 1984].
Группа нейтральных компонентов содержит множество полиядерных ароматических углеводородов и проявляет большую часть канцерогенной активности, связанной с сигаретным дымом. К известным канцерогенам этой фракции относятся бензопирен и дибензантрацен, а также инсектициды на основе хлорированных углеводородов. Они вызывают как доброкачественные, так и злокачественные опухоли. Группа кислых компонентов содержит соединения, проявляющие коканцерогенную и опухолестимулирующую активность, а также ряд сильнодействующих мутагенов. Коканцерогены определяются как слабые канцерогены, которые усиливают активность других канцерогенов. К группе основных компонентов относятся никотин и W- нитрозонорникотин. Аналогичные соединения содержатся в кислой фракции табачной смолы [Van Duuren, 1973]. При сжигании табака из никотина и родственных ему алкалоидов образуется ряд канцерогенных нитрозаминов. Два из этих специфичных для табака нитрозаминов: W-нитрозонорникотин и 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон, являются исключительно сильными канцерогенами. Было высказано предположение, что высокая концентрация нитрозаминов в нюхательном табаке является причиной рака ротовой полости [Smoking and lung cancer: an overview, 1984].
1. Частота мутаций гена EGFR у 50 некурящих пациентов с аденокарциномой легкого составляет 36,0 %, из них 72,2 % мутаций выявлено у женщин, 27,8 % - у мужчин.
2. Оптимизирован метод поиска делеции 14 экзона гена МЕТ. Разработаны 2 пары специфичных праймеров к его нуклеотидной последовательности, и определена оптимальная температура их отжига, равная 60 °С.
3. Среди 32 пациентов с аденокарциномой легкого с отрицательным статусом мутации гена EGFR делеции 14 экзона гена МЕТ не обнаружено.
2. Оптимизирован метод поиска делеции 14 экзона гена МЕТ. Разработаны 2 пары специфичных праймеров к его нуклеотидной последовательности, и определена оптимальная температура их отжига, равная 60 °С.
3. Среди 32 пациентов с аденокарциномой легкого с отрицательным статусом мутации гена EGFR делеции 14 экзона гена МЕТ не обнаружено.
