Аннотация 2
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Система репарации клетки 7
1.1.1 Повреждение ДНК и репарация: ключевой механизм сохранения геномной
стабильности 7
1.1.2 Основные механизмы репарации 8
1.1.2.1 Репарация ДНК по механизму фотоактивации 10
1.1.2.2 Репарация ДНК по механизму эксцизионной репарации 11
1.1.2.3 Альтернативный путь репарации ДНК 12
1.2 Использование белков системы репарации ДНК в генной инженерии 13
1.2.1 Идентификация новых белков репарации ДНК 13
1.2.2 Идентификация гена Anoph и оптимизация для экспрессии рекомбинантного
белка 14
1.3 E. coli как система экспрессии 16
1.3.1 Преимущества и ограничения экспрессии в E. coli 16
1.3.2 Обзор векторных конструкций для экспрессии рекомбинантных белков 17
1.3.2.1 Составные части экспрессионной плазмиды: репликон 18
1.3.2.2 Аффинные теги 19
1.3.2.3 Промоторные системы Escherichia coli 20
2 Материалы и методы исследования 24
2.1 Молекулярное клонирование гена Anoph в плазмидные вектора pET-21b и pET-23b 24
2.1.1 Рестрикция рекомбинантного плазмидного вектора 24
2.1.2 Выделение из геля рестрицированный ДНК фрагментов 24
2.1.3 Лигирование рекомбинантного плазмидного вектора 24
2.1.4 Трансформация рекомбинантных плазмидных векторов pET-21b_Anoph и pET-
23b_Anoph, содержащих ген Anoph, в штамм поддержки E. coli DH5a и в штамм экспрессии E. coli БЕ21с дальнейшим посевом на твердую среду 26
2.1.5 Пересев бактериальной культуры на жидкую среду 27
2.1.6 Выделение плазмидной ДНК из бактериальных штаммов DH5a 27
2.2 Проверка эффективности встраивания вставки, содержащей ген Anoph, в плазмидные вектора pET-21b и pET-23b 27
2.2.1 Подбор оптимальных условий для анализирующей рестрикции в ПО SnapGene ..27
2.2.2 Проверка эффективности трансформации бактериального штамма DH5a
рекомбинантными плазмидами pET-21b_Anoph и pET-23b_Anoph с помощью анализирующей рестрикции 28
2.2.3 Визуализация рестрицированных ДНК фрагментов методом гель-электрофореза 29
2.2.4 Проверка эффективности создания рекомбинантных плазмидных векторов pET-
21b_Anoph и pET-23b_Anoph с помощью colony-PCR 29
3 Результаты и обсуждение 31
3.1 Создание рекомбинантных векторов, на основе плазмид pET-21b и pET-23b
содержащих ген Anoph из Anopheles gambiae 31
3.2 Подтверждение создания рекомбинантных плазмидных векторов pET-21b и pET-
23b , содержащих ген Anoph методом colony-PCR 34
3.3 Подтверждение создания рекомбинантных плазмидных векторов pET-21b и pET-
23b, содержащих ген Anoph методом анализирующей рестрикции 36
3.4 Подтверждение создания рекомбинантных плазмидных векторов pET-21b и pET-
23b, содержащих ген Anoph методом секвенирования 38
3.5 Получение штаммов экспрессии E. coli BL21 (DE3) трансформированных
плазмидными векторами pET-21b_ Anoph и pET-23b_ Anoph 38
3.6 Подтверждение этапа создания бактериальных штаммов экспрессии BL21 (DE3),
содержащих pET-21b_ Anoph и pET-23b_ Anoph 40
ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 43
Организмы на протяжение всей своей жизни встречаются с разнообразными повреждениями своего генома под действием агентов как экзогенного, так и эндогенного происхождения. И то, какое количество механизмов по устранению возникших изменений в структуре и целостности ДНК существует у организмов представляет значительный научный интерес у исследователей. Но помимо непосредственного изучения механизмов репарации ДНК, интерес также заслуживают участники этих процессов, а именно белки. Они являются интересным объектом для изучения их пространственной структуры, биохимических свойств, состав и взаимное расположение доменов, а также нуклеотидные последовательности генов, кодирующие эти белки.
Одним из перспективных направлений генной инженерии является поиск и разработка молекулярных инструментов для проектирования и редактирования генетических конструкций. Белки системы репарации представляют интерес для применения в этой сфере. Потенциальное использование этих белков в качестве новых инструментов генной инженерии или для усовершенствования уже имеющихся требует получения их чистых фракций и анализа их свойств. Одним из эффективных подходов является создание рекомбинантных ДНК-конструкции на основе плазмидных векторов с интеграцией гена исследуемого белка. Такая система обеспечивает экспрессию целевого белка в бактериальных штаммах, позволяя получать достаточное количество для дальнейшего изучения.
В данной работе проводилось создание рекомбинантного плазмидного вектора, содержащего ген белка Anoph. Исследуемый белок был найден у Anopheles gambiae на основе гомологии с белком Amun, который обладает ДНК-гликозилазной активностью и ранее был выделен из Drosophila melanogaster. Ферменты группы ДНК-гликозилаз участвуют в эксцизионной репарации оснований (BER), разрывая N-гликозидную связь между поврежденным основанием и дезоксирибозой, что приводит к образованию АП - сайта. Примером применения этого свойства ДНК-гликозилаз в исследованиях является урацил-ДНК-гликозилаза, широко используемая в ПЦР для предотвращения контаминации и ложноположительных результатов [Longo M. C., 1990]. Целью работы является получение штамма экспрессии на основе E. coli содержащего плазмидную ДНК с геном Anoph для наработки целевого белка.
Задачи:
1) Создание рекомбинантных плазмидных векторов на основе pET-21 b и pET- 23b, содержащих ген белка Anoph методом молекулярного клонирования.
2) Трансформация плазмидных векторов pET-21b_Anoph и pET-23b_Anoph в бактериальный штамм экспрессии E. coli.
3) Методами анализирующей рестрикции и Colony PCR проверка эффективности создания рекомбинантных векторов для гиперпродукции белка Anoph.
4) Подготовка образцов рекомбинантных векторов pET-21b_Anoph и pET- 23b_Anoph для секвенирования. Анализ результатов секвенирования.
1. Созданы рекомбинантные плазмидные вектора на основе pET-21b и pET-23b, содержащие ген белка Anoph с помощью метода молекулярного клонирования.
2. Получены бактериальные штаммы экспрессии E. coli BL21 (DE3), содержащие рекомбинантные плазмидные вектора pET-21b_Anoph и pET-23b_Anoph.
3. Методами анализирующей рестрикции, Colony PCR и секвенированием по Сэнгеру подтверждена эффективность создания рекомбинантных векторов pET-21b_Anoph и pET-23b_Anoph для гиперпродукции белка Anoph. Полученный штаммы E. coli BL21 (DE3), содержащие плазмидные вектора pET-21b_Anoph и pET-23b_Anoph, можно использовать для экспрессии целевого белка.
