СОЧЕТАННОЕ ДЕЙСТВИЕ ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОГО МИКРОВОЛНОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ХИМИОПРЕПАРАТОВ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ IN VITRO
|
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1. Химиотерапия 8
1.2. Механизмы формирования множественной лекарственной устойчивости 9
1.3. Комбинированная терапия 11
1.4. Характеристика ЭМИ 12
1.4.1. Физико-химические механизмы действия ионизирующих излучений 12
1.4.2 Механизмы повреждающего действия ионизирующего излучения на
биологические объекты 13
1.4.3. Повреждающее действие ИИ на нуклеиновые кислоты 14
1.4.4. Способность ИИ индуцировать процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) 15
1.5. Характеристика микроволнового излучения 16
1.5.1. Биологические эффекты, вызываемые неионизирующим излучением 17
1.6. Импульсно-периодическое излучение 18
1.7. Электропорация 18
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1. Клеточные линии 23
2.1.1. HeLa 23
2.1.2. K562 23
2.1.3. MCF7 23
2.2. Методика культивирования опухолевых клеток 24
2.3. Методы оценки пролиферативной активности и выживаемости опухолевых клеток 25
2.3.1. МТТ-тест (MTT-test) 25
2.3.2. Метод колоний polony counting method) 25
2.3.3. iCELLigence 26
2.4. Доксорубицин 27
2.5 Источники наносекундных импульсно-периодических излучений 28
2.5.1. Источник ИПМИ 28
2.5.2. Источник ИПВЧ 29
2.6. Статистическая обработка данных 29
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 30
3.1.1. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПМИ и доксорубицина с помощью МТТ-теста 30
3.1.2. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПМИ и доксорубицина с помощью метода колоний 33
3.2.1 Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью MTT-теста 36
3.2.2. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью метода колоний 37
3.2.3. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с iCELLigence 39
3.3.1. Оценка пролиферативной активности клеток K562 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью MTT-теста 41
3.4.2. Оценка пролиферативной активности клеток MCF7 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью MTT-теста 43
3.4.2. Оценка пролиферативной активности клеток MCF7 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью метода колоний 44
3.4.3. Оценка пролиферативной активности клеток MCF7 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью iCELLigence 45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
ВЫВОДЫ 49
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 50
ВВЕДЕНИЕ 5
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1. Химиотерапия 8
1.2. Механизмы формирования множественной лекарственной устойчивости 9
1.3. Комбинированная терапия 11
1.4. Характеристика ЭМИ 12
1.4.1. Физико-химические механизмы действия ионизирующих излучений 12
1.4.2 Механизмы повреждающего действия ионизирующего излучения на
биологические объекты 13
1.4.3. Повреждающее действие ИИ на нуклеиновые кислоты 14
1.4.4. Способность ИИ индуцировать процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) 15
1.5. Характеристика микроволнового излучения 16
1.5.1. Биологические эффекты, вызываемые неионизирующим излучением 17
1.6. Импульсно-периодическое излучение 18
1.7. Электропорация 18
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 23
2.1. Клеточные линии 23
2.1.1. HeLa 23
2.1.2. K562 23
2.1.3. MCF7 23
2.2. Методика культивирования опухолевых клеток 24
2.3. Методы оценки пролиферативной активности и выживаемости опухолевых клеток 25
2.3.1. МТТ-тест (MTT-test) 25
2.3.2. Метод колоний polony counting method) 25
2.3.3. iCELLigence 26
2.4. Доксорубицин 27
2.5 Источники наносекундных импульсно-периодических излучений 28
2.5.1. Источник ИПМИ 28
2.5.2. Источник ИПВЧ 29
2.6. Статистическая обработка данных 29
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 30
3.1.1. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПМИ и доксорубицина с помощью МТТ-теста 30
3.1.2. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПМИ и доксорубицина с помощью метода колоний 33
3.2.1 Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью MTT-теста 36
3.2.2. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью метода колоний 37
3.2.3. Оценка пролиферативной активности клеток HeLa после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с iCELLigence 39
3.3.1. Оценка пролиферативной активности клеток K562 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью MTT-теста 41
3.4.2. Оценка пролиферативной активности клеток MCF7 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью MTT-теста 43
3.4.2. Оценка пролиферативной активности клеток MCF7 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью метода колоний 44
3.4.3. Оценка пролиферативной активности клеток MCF7 после сочетанного воздействия
наносекундного ИПВЧ и доксорубицина с помощью iCELLigence 45
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 47
ВЫВОДЫ 49
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 50
Высокая преждевременная смертность от онкологических заболеваний - одна из основных проблем демографии и причин отставания России от развитых стран по продолжительности жизни. По данным IARC (Международного Агентства по Исследованию Рака), в 2016 году Россия занимает 6-е место по числу смертей от онкологических заболеваний. На сегодняшний день, существует несколько основных методов лечения онкологических заболеваний: хирургическое вмешательство, химиотерапия, лучевая терапия и иммунотерапия. Комбинированная терапия, при которой происходит сочетание нескольких методов, приобретает большую востребованность в медицинской практике.
Химиотерапия в настоящее время является также одним из основных способов лечения онкологических заболеваний, а в некоторых формах и стадиях заболевания - единственным методом лечения. В последние годы активно исследуются устойчивость опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам (Нейфах А.А., 2003; Блохин Д.Ю., 2009).
Наиболее серьезным препятствием на пути успешного лечения специфической химиотерапией является приобретение клетками фенотипа множественной лекарственной устойчивости - феномен «ускользания» опухолевой клетки из-под действия химиопрепарата. В ответ на введенный в клетку препарат запускаются механизмы, способствующие активному выведению этого препарата из клетки (ABC-транспортеры), восстановлению поврежденных структур клетки, контролю запуска апоптоза и механизмы, активирующие систему внутриклеточной детоксикации (цитохром P450, система глутатиона). В результате приобретающая подобный фенотип опухолевая клетка способна преодолевать химически агрессивные для неё условия, расти и размножаться. Именно потомки этой клетки определяют дальнейший рост и прогрессию опухоли в организме.
В России исследование биологического действия микроволн с целью использования их в лечебных целях было начато Ф. М. Супоницкой в 1938 г. C 1947 года микроволны стали использовать в физиотерапии благодаря исследованиям термогенного действия микроволнового излучения и возможностям локального облучения на различной глубине (Гордон З. В., 1966.)
Исследования, проведенные в последние десятилетия показывают, что наиболее сильный эффект на биологические объекты оказывает импульсно-периодическое излучение, по сравнению с неимпульсными воздействием этого же вида излучения (Litvyakov N. V. et. al., 2005). В этом случае полученные эффекты зависят от частоты повторения импульсов (ЧПИ) (Большаков М.А. с соавт., 2002; Литвяков Н.В. с соавт., 2005, 2006; Григорьев Ю. Г., 1996; Adey W. R., 1980; Кудряшов Ю. Б., 2001; Даренская Н. Г. с соавт., 1997). Еще в 80-е годы прошлого столетия был определен диапазон частот, при которых наблюдается усиление реакции объектов на действие ЭМИ - от 0 до 40 Гц (Adey W.R., 1980, 1981).
В ряде работ показано, что высокочастотные наносекундные электрические импульсы способны значительно увеличить проницаемость мембран клеток за счёт электропорации (Nuccitelli R. et al., 2006; Pakhomov A. G. et al., 2018). Образовавшиеся поры (электропоры) можно использовать для доставки химиопрепарата внутрь. Благодаря этому значительно увеличивается концентрация лекарственного вещества внутри клетки, удлиняется его пребывание и фармакотерапевтическое действие. Электропорация известна в медицинской практике в течение 20 лет. Онкобольным проводят инвазивную электрохимиотерапию путём введения под кожу электродов с местным введение химиопрепарата.
В этой связи представлялось актуальным исследовать способность импульсно-периодического микроволнового излучения и импульсно-периодического высокочастотного излучения облегчать проникновение лекарственного агента внутрь опухолевой клетки для длительного пребывания и взаимодействия с ДНК.
Цель работы: оценить способность наносекундных импульсно-периодического микроволнового излучения (ИПМИ) и импульсно-периодического высокочастотного излучения (ИПВЧ) за счёт электропорации усиливать пролонгированное действие доксорубицина на опухолевые клетки.
Для выполнения поставленной цели решены задачи:
1. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии HeLa после сочетанного воздействия ИПМИ и доксорубицина на первые и седьмые сутки.
2. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии HeLa после сочетанного воздействия ИПВЧ и доксорубицина на первые, пятые и седьмые сутки.
3. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии K562 после сочетанного воздействия ИПВЧ и доксорубицина на первые, пятые и седьмые сутки.
4. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии MCF7 после воздействия ИПВЧ и доксорубицина на первые и седьмые сутки.
Работы выполнена на базе Томского НИИ Онкологии ТНИМЦ РАН лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии, отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск) и кафедры физиологии человека и животных Национального исследовательского Томского государственного университета.
Выражаю благодарность своим научным руководителям за помощь в проведении эксперимента, обсуждение результатов и огромную поддержку:
Михаилу Александровичу Булдакову, старшему научному сотруднику лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии НИИ Онкологии Томского НИМЦ;
Михаилу Алексеевичу Большакову, профессору кафедры физиологии человека и животных Биологического института НИ ТГУ;
Олегу Петровичу Кутенкову, ведущему инженеру-электронику Отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск).
Химиотерапия в настоящее время является также одним из основных способов лечения онкологических заболеваний, а в некоторых формах и стадиях заболевания - единственным методом лечения. В последние годы активно исследуются устойчивость опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам (Нейфах А.А., 2003; Блохин Д.Ю., 2009).
Наиболее серьезным препятствием на пути успешного лечения специфической химиотерапией является приобретение клетками фенотипа множественной лекарственной устойчивости - феномен «ускользания» опухолевой клетки из-под действия химиопрепарата. В ответ на введенный в клетку препарат запускаются механизмы, способствующие активному выведению этого препарата из клетки (ABC-транспортеры), восстановлению поврежденных структур клетки, контролю запуска апоптоза и механизмы, активирующие систему внутриклеточной детоксикации (цитохром P450, система глутатиона). В результате приобретающая подобный фенотип опухолевая клетка способна преодолевать химически агрессивные для неё условия, расти и размножаться. Именно потомки этой клетки определяют дальнейший рост и прогрессию опухоли в организме.
В России исследование биологического действия микроволн с целью использования их в лечебных целях было начато Ф. М. Супоницкой в 1938 г. C 1947 года микроволны стали использовать в физиотерапии благодаря исследованиям термогенного действия микроволнового излучения и возможностям локального облучения на различной глубине (Гордон З. В., 1966.)
Исследования, проведенные в последние десятилетия показывают, что наиболее сильный эффект на биологические объекты оказывает импульсно-периодическое излучение, по сравнению с неимпульсными воздействием этого же вида излучения (Litvyakov N. V. et. al., 2005). В этом случае полученные эффекты зависят от частоты повторения импульсов (ЧПИ) (Большаков М.А. с соавт., 2002; Литвяков Н.В. с соавт., 2005, 2006; Григорьев Ю. Г., 1996; Adey W. R., 1980; Кудряшов Ю. Б., 2001; Даренская Н. Г. с соавт., 1997). Еще в 80-е годы прошлого столетия был определен диапазон частот, при которых наблюдается усиление реакции объектов на действие ЭМИ - от 0 до 40 Гц (Adey W.R., 1980, 1981).
В ряде работ показано, что высокочастотные наносекундные электрические импульсы способны значительно увеличить проницаемость мембран клеток за счёт электропорации (Nuccitelli R. et al., 2006; Pakhomov A. G. et al., 2018). Образовавшиеся поры (электропоры) можно использовать для доставки химиопрепарата внутрь. Благодаря этому значительно увеличивается концентрация лекарственного вещества внутри клетки, удлиняется его пребывание и фармакотерапевтическое действие. Электропорация известна в медицинской практике в течение 20 лет. Онкобольным проводят инвазивную электрохимиотерапию путём введения под кожу электродов с местным введение химиопрепарата.
В этой связи представлялось актуальным исследовать способность импульсно-периодического микроволнового излучения и импульсно-периодического высокочастотного излучения облегчать проникновение лекарственного агента внутрь опухолевой клетки для длительного пребывания и взаимодействия с ДНК.
Цель работы: оценить способность наносекундных импульсно-периодического микроволнового излучения (ИПМИ) и импульсно-периодического высокочастотного излучения (ИПВЧ) за счёт электропорации усиливать пролонгированное действие доксорубицина на опухолевые клетки.
Для выполнения поставленной цели решены задачи:
1. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии HeLa после сочетанного воздействия ИПМИ и доксорубицина на первые и седьмые сутки.
2. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии HeLa после сочетанного воздействия ИПВЧ и доксорубицина на первые, пятые и седьмые сутки.
3. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии K562 после сочетанного воздействия ИПВЧ и доксорубицина на первые, пятые и седьмые сутки.
4. Исследовать пролиферативную активность и выживаемость опухолевых клеток линии MCF7 после воздействия ИПВЧ и доксорубицина на первые и седьмые сутки.
Работы выполнена на базе Томского НИИ Онкологии ТНИМЦ РАН лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии, отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск) и кафедры физиологии человека и животных Национального исследовательского Томского государственного университета.
Выражаю благодарность своим научным руководителям за помощь в проведении эксперимента, обсуждение результатов и огромную поддержку:
Михаилу Александровичу Булдакову, старшему научному сотруднику лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии НИИ Онкологии Томского НИМЦ;
Михаилу Алексеевичу Большакову, профессору кафедры физиологии человека и животных Биологического института НИ ТГУ;
Олегу Петровичу Кутенкову, ведущему инженеру-электронику Отдела физической электроники Института сильноточной электроники СО РАН (г. Томск).
Исходя из имеющихся литературных данных, мы предположили, что одним из возможных механизмов усиления цитостатического действия доксорубицина на опухолевые клетки может являться процесс электропорации, индуцируемый наносекундным ипульсно- периодическим микроволновым и высокочастотным излучениями. При относительно низких внеклеточных накоплениях препарата образуемые электропоры в опухолевых клетках, по- видимому, могут увеличить внутриклеточную концентрацию препарата до уровня, который во много раз превышает тот, который обычно наблюдается при традиционной фармакотерапии. Тем самым достигаются высокие внутриклеточные концентрации. Так как электропорация расширяет поры и увеличивает проницаемость клетки кратковременно, то проникший внутрь препарат, попадает в «ловушку» из-за того, что проницаемость клеточной мембраны быстро восстанавливается (становится низкой). Таким образом, значительно увеличивается концентрация лекарственного вещества внутри клетки, удлиняется его пребывание и фармакотерапевтическое действие. В конечном счете это приводит к созданию высокой фармакотерапевтической активности доксорубицина.
Таким образом, импульсно-периодическое микроволновое излучение в зависимости от частот повторения импульсов способно усиливать эффект противоопухолевых химиопрепаратов. Однако этот эффект отмечается только через сутки после облучения. Вероятно, дальнейшему усилению эффекта мешают репарационные процессы запускающиеся в клетке. По-видимому, для сохранения эффекта ингибирования клеточной пролиферации на 7-е сутки необходимо проводить повторное облучение клеточной культуры.
Электрохимиотерапия является эффективным, безопасным, недорогим одноразовым лечением, которое может быть предложено онкологическим больным с опухолью различных гистологий. На сегодняшний день электропорацию проводят с использованием пластинчатых или иглопробивных электродов под местной или общей анестезией. Она используется как средство облегчения транспортировки непроникающих (или проникающих в недостаточном количестве) молекул в клетки.
Результаты работы способствуют лучшему пониманию эффектов и механизмов действия на опухолевые клетки импульсно-периодического микроволнового и высокочастотного излучений в сочетанном действии с химиопрепратом. Исследование действия на опухолевые клетки в зависимости от частоты повторения импульсов, количества импульсов за сеанс и напряженности внешнего поля позволили выявить новые закономерности действия, которые вносят существенный вклад в развитие представлений о влиянии импульсно-периодических источников неионизирующих излучений на клеточном уровне.
Полученные результаты требуют дальнейшего экспериментального подтверждения и могут быть перспективными в использовании неинвазивной низкоинтенсивной терапии злокачественных новообразований, которая, в свою очередь, будет повышать эффективность лекарственной терапии и снижать системные токсические нежелательные реакции в отношении здоровых клеток организма.
Таким образом, импульсно-периодическое микроволновое излучение в зависимости от частот повторения импульсов способно усиливать эффект противоопухолевых химиопрепаратов. Однако этот эффект отмечается только через сутки после облучения. Вероятно, дальнейшему усилению эффекта мешают репарационные процессы запускающиеся в клетке. По-видимому, для сохранения эффекта ингибирования клеточной пролиферации на 7-е сутки необходимо проводить повторное облучение клеточной культуры.
Электрохимиотерапия является эффективным, безопасным, недорогим одноразовым лечением, которое может быть предложено онкологическим больным с опухолью различных гистологий. На сегодняшний день электропорацию проводят с использованием пластинчатых или иглопробивных электродов под местной или общей анестезией. Она используется как средство облегчения транспортировки непроникающих (или проникающих в недостаточном количестве) молекул в клетки.
Результаты работы способствуют лучшему пониманию эффектов и механизмов действия на опухолевые клетки импульсно-периодического микроволнового и высокочастотного излучений в сочетанном действии с химиопрепратом. Исследование действия на опухолевые клетки в зависимости от частоты повторения импульсов, количества импульсов за сеанс и напряженности внешнего поля позволили выявить новые закономерности действия, которые вносят существенный вклад в развитие представлений о влиянии импульсно-периодических источников неионизирующих излучений на клеточном уровне.
Полученные результаты требуют дальнейшего экспериментального подтверждения и могут быть перспективными в использовании неинвазивной низкоинтенсивной терапии злокачественных новообразований, которая, в свою очередь, будет повышать эффективность лекарственной терапии и снижать системные токсические нежелательные реакции в отношении здоровых клеток организма.
