ВЫЯВЛЕНИЕ И СОХРАНЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ МАКРОМИЦЕТОВ ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМ ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ
|
Аннотация 2
Введение 5
1. Макромицеты фармацевтического назначения 8
1.1 Этномикологический обзор 8
1.2 Систематика грибов 10
1.3 Фунготерапия 12
1.4 Виды макромицетов, перспективные для фунготерапии 13
1.5 Биохимический состав макромицетов 17
1.6 Лекарственные свойства грибов 19
1.7 Клинические испытания 21
1.8 Использование высших грибов для создания лекарственных препаратов 23
1.9 Противовирусная и противоопухолевая активности гриба Neolentinus lepideus 25
1.10 Промышленное культивирование грибов 26
1.11 Биоразнообразие макромицетов Томской области 32
2. Материалы и методы исследований 34
2.1 Природно-климатические условия района сбора макромицетов 34
2.2 Метод сбора и идентификации плодовых тел по макропризнакам 36
2.3 Правила работы в стерильных условиях 37
2.4 Приготовление искусственных питательных сред 38
2.5 Выделение чистых культур из плодовых тел 40
2.5.1 Метод поверхностного культивирования 40
2.5.2 Метод глубинного культивирования 41
2.6 Методика определения содержания водорастворимого белка 41
2.7 Микрометод определения редуцирующих сахаров 42
2.8 Контроль контаминации микофильными грибами 43
2.9 Молекулярно-генетическая идентификация вида макромицета 43
3. Результаты и обсуждение 47
3.1 Идентификация вида 47
3.1.1 Определение макромицетов по макропризнакам 47
3.1.2 Введение вида в культуру 48
3.1.3 Молекулярно-генетическая паспортизация вида по плодовому телу и чистой культуре in
vitro 48
3.2 Динамика роста мицелия в жидкой культуре in vitro 49
3.3 Список элюатов для скрининга фармакологически значимых макромицетов 51
3.4 Оптимизация питательной среды для культивирования макромицетов 58
3.4.1 Пилолистник чешуйчатый (Neolentinus lepideus) 59
3.4.2 Свинушка тонкая (Paxillus involutus) 59
3.4.3 Масленок сибирский (Suillus sibiricus) 60
Выводы 61
Заключение 62
Список использованной литературы 63
Введение 5
1. Макромицеты фармацевтического назначения 8
1.1 Этномикологический обзор 8
1.2 Систематика грибов 10
1.3 Фунготерапия 12
1.4 Виды макромицетов, перспективные для фунготерапии 13
1.5 Биохимический состав макромицетов 17
1.6 Лекарственные свойства грибов 19
1.7 Клинические испытания 21
1.8 Использование высших грибов для создания лекарственных препаратов 23
1.9 Противовирусная и противоопухолевая активности гриба Neolentinus lepideus 25
1.10 Промышленное культивирование грибов 26
1.11 Биоразнообразие макромицетов Томской области 32
2. Материалы и методы исследований 34
2.1 Природно-климатические условия района сбора макромицетов 34
2.2 Метод сбора и идентификации плодовых тел по макропризнакам 36
2.3 Правила работы в стерильных условиях 37
2.4 Приготовление искусственных питательных сред 38
2.5 Выделение чистых культур из плодовых тел 40
2.5.1 Метод поверхностного культивирования 40
2.5.2 Метод глубинного культивирования 41
2.6 Методика определения содержания водорастворимого белка 41
2.7 Микрометод определения редуцирующих сахаров 42
2.8 Контроль контаминации микофильными грибами 43
2.9 Молекулярно-генетическая идентификация вида макромицета 43
3. Результаты и обсуждение 47
3.1 Идентификация вида 47
3.1.1 Определение макромицетов по макропризнакам 47
3.1.2 Введение вида в культуру 48
3.1.3 Молекулярно-генетическая паспортизация вида по плодовому телу и чистой культуре in
vitro 48
3.2 Динамика роста мицелия в жидкой культуре in vitro 49
3.3 Список элюатов для скрининга фармакологически значимых макромицетов 51
3.4 Оптимизация питательной среды для культивирования макромицетов 58
3.4.1 Пилолистник чешуйчатый (Neolentinus lepideus) 59
3.4.2 Свинушка тонкая (Paxillus involutus) 59
3.4.3 Масленок сибирский (Suillus sibiricus) 60
Выводы 61
Заключение 62
Список использованной литературы 63
На территории Томской области выделяют четыре природно-зональных растительных комплекса от средней тайги до лесостепи. Северная часть области, приблизительно до ее середины, по руслам рек Чая и Кеть, относится к зоне средней тайги, для которой характерно доминирование кедра, ели и сосны. Мелколиственные леса имеют вторичное происхождение и представлены несколькими видами берез и осиной. Огромные территории занимают верховые болота. В южно-таежных лесах, распространенных практически до южных границ области, встречаются участки пихтарника с примесью ели, кедра и сосны, которые чередуются с большими массивами вторичных березовых и осиновых лесов, возникших на местах гарей и рубок. На юго-востоке области небольшую территорию занимают подтаежные леса, основу которых составляют мелколиственные виды деревьев (береза и осина). Крайний юг Томской области входит в лесостепную зону, где осиново-березовые колки чередуются с остепненными лугами. В междуречье Оби и Енисея, в пределах области, прослеживаются линейно вытянутые древние ложбины стока, ориентированные с северо- востока на юго-запад, на песчаных отложениях которых произрастают сосновые боры. Территория области с точки зрения микологии представляет собой интересный, но еще мало исследованный район [1]. По материалам лесоустройства, лишайниковые, бруснично-лишайниковые, бруснично-зеленомошно-лишайниковые и зеленомошные сосняки занимают около 7% площади лесов Томской области. На наиболее продуктивные лишайниковые сосняки приходится не более 1%. Однако сосняки, являясь базовыми территориями для заготовок грибов в Томской области, наименее изучены с точки зрения видового состава макромицетов [2].
Базидиальные грибы обладают широким спектром биологически активных веществ, а их лечебные свойства использовались с глубокой древности [3]. Также макромицеты продуцируют вторичные метаболиты различного терапевтического действия.
Например, в Японии из плодовых тел дикорастущих и культивируемых грибов выпускают препараты, содержащие полисахариды и их комплексы с белками, которые широко используются при лечении онкологических заболеваний. Наиболее известные из них: лентинан (из шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler 1976), полисахаридпептид и полисахарид Крестин (из траметеса разноцветного Trametes versicolor (L.) Lloyd 1921), ганодеран (из трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. 1881), плевран (из вешенки устричной (обыкновенной) Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. 1871), грифолан (из грифолы курчавой Grifola frondosa (Dicks.) Gray 1821) [4].
В России описано примерно 4000 видов макромицетов, из них съедобных около 300, в Томске же используют не более 15 видов в силу низкой культуры потребления.
В настоящее время во всем мире возрастает интерес к разработке медикаментозных средств на основе природных экологически чистых соединений. Одним из перспективных источников получения лекарственных препаратов являются высшие грибы. Поиск и выделение новых видов и штаммов лекарственных грибов из природных местообитаний в культуру открывает перспективу пополнения коллекций активными продуцентами для развития медицинской биотехнологии [4]. Коллекция чистых культур высших грибов имеет практическое значение для изучения, выделения биологически активных компонентов и отбора наиболее эффективных и продуктивных штаммов, на основе которых могут быть разработаны фармакологические препараты[5]. Выделение базидиальных грибов в культуру и сохранение их в коллекции имеют большое значение также в связи с Международной Конвенцией о сохранении биологического разнообразия[4].
Исследования высших базидиомицетов в культуре были начаты в 80-х годах прошлого столетия, однако вопрос о возможности практического использования чистой мицелиальной культуры этих грибов возник только в 50-х годах XX столетия в связи с общим прогрессом промышленного культивирования мицелиальных грибов для производства антибиотиков [6]. В монографии А. С. Бухало обобщены данные с 1877 года о морфологии и биологии высших базидиомицетов в чистой культуре, изложены методы выделения, закономерности роста, критерии идентификации [7]. Сегодня данной теме посвящены исследования отечественных ученых - Б.Н. Огаркова, И. А. Горбуновой, Т. В. Тепляковой, Т. А. Косоговой, Н. В. Беловой, Феофиловой Е. П. и зарубежных - Ki Nam Yoon, Artur Szwengiel, Hung-Tsung Wu [4, 5, 7-12, 22, 35, 42]. Существенный вклад в изучение видового состава макромицетов Томской области был сделан в конце 60-х годов прошлого столетия микологами Томского госуниверситета [13], на сегодняшний день сотрудники Томского государственного университета Н. Н. Кудашова и С. И. Гашков изучают биоразнообразие макромицетов и дополняют список коллекции грибов Томской области [13-15].
Работа была выполнена на базе НИИ ТГУ в малом инновационном предприятии «Микобакс» в 2016-2017 гг. под руководством кандидата биологических наук, доцента Ольги Борисовны Вайшля.
Объект исследования- макромицеты Томской области.
Предмет исследования- культуры Neolentinus lepideus (Fr.) Redhead & Ginns 1985, Paxillus involutus (Batsch) Fr. 1838, Suillus sibiricus (Singer) Singer 1945.
Цель данной работы - выявление фармакологически значимых макромицетов Томской области и сохранение их в коллекции in vitro.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделение чистых культур из плодовых тел макромицетов;
2. Создание списка элюатов и режимов для получения БАВ из макромицетов;
3. Оптимизация питательной среды для Neolentinus lepideus, Paxillus involutus, Suillus sibiricus;
4. Изучение динамики роста Neolentinus lepideus на жидких питательных средах путем измерения концентрации глюкозы и водорастворимого белка в культуральной жидкости.
Защищаемые положения:
1. Гриб, найденный в Лоскутовском припоселковом кедровнике, идентифицирован как Пилолистник чешуйчатый (Neolentinus lepideus);
2. С целью накопления биомассы гриба Neolentinus lepideus необходимо использовать 6-12 суточную культуру при глубинном культивировании штамма 5391;
3. Оптимальной средой культивирования Neolentinus lepideus является среда Пашевского, Paxillus involutus- среда Хагема, Suillus sibiricus- среда Худякова - Возняковской.
По материалам выпускной квалификационной работы опубликовано два материала в сборнике материалов «Старт в науку» [16, 17] и одна статья в сборнике тезисов
Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» [18].
Автор работы выражает благодарность своему научному руководителю О.Б. Вайшля и инженеру-микробиологу ООО «Микобакс» Н.В. Шабалиной за неоценимую помощь в освоении методов культивирования макромицетов; за помощь в определении систематической принадлежности макромицетов - старшему научному сотруднику НИИББ ТГУ Н.Н. Агафоновой; старшему преподавателю кафедры Экологии и безопасности жизнедеятельности Института неразрушающего контроля ТПУ А. Г. Кагирову - за предоставление портативного спектрофотометра для исследования скорости роста жидкой культуры макромицетов.
Базидиальные грибы обладают широким спектром биологически активных веществ, а их лечебные свойства использовались с глубокой древности [3]. Также макромицеты продуцируют вторичные метаболиты различного терапевтического действия.
Например, в Японии из плодовых тел дикорастущих и культивируемых грибов выпускают препараты, содержащие полисахариды и их комплексы с белками, которые широко используются при лечении онкологических заболеваний. Наиболее известные из них: лентинан (из шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler 1976), полисахаридпептид и полисахарид Крестин (из траметеса разноцветного Trametes versicolor (L.) Lloyd 1921), ганодеран (из трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. 1881), плевран (из вешенки устричной (обыкновенной) Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. 1871), грифолан (из грифолы курчавой Grifola frondosa (Dicks.) Gray 1821) [4].
В России описано примерно 4000 видов макромицетов, из них съедобных около 300, в Томске же используют не более 15 видов в силу низкой культуры потребления.
В настоящее время во всем мире возрастает интерес к разработке медикаментозных средств на основе природных экологически чистых соединений. Одним из перспективных источников получения лекарственных препаратов являются высшие грибы. Поиск и выделение новых видов и штаммов лекарственных грибов из природных местообитаний в культуру открывает перспективу пополнения коллекций активными продуцентами для развития медицинской биотехнологии [4]. Коллекция чистых культур высших грибов имеет практическое значение для изучения, выделения биологически активных компонентов и отбора наиболее эффективных и продуктивных штаммов, на основе которых могут быть разработаны фармакологические препараты[5]. Выделение базидиальных грибов в культуру и сохранение их в коллекции имеют большое значение также в связи с Международной Конвенцией о сохранении биологического разнообразия[4].
Исследования высших базидиомицетов в культуре были начаты в 80-х годах прошлого столетия, однако вопрос о возможности практического использования чистой мицелиальной культуры этих грибов возник только в 50-х годах XX столетия в связи с общим прогрессом промышленного культивирования мицелиальных грибов для производства антибиотиков [6]. В монографии А. С. Бухало обобщены данные с 1877 года о морфологии и биологии высших базидиомицетов в чистой культуре, изложены методы выделения, закономерности роста, критерии идентификации [7]. Сегодня данной теме посвящены исследования отечественных ученых - Б.Н. Огаркова, И. А. Горбуновой, Т. В. Тепляковой, Т. А. Косоговой, Н. В. Беловой, Феофиловой Е. П. и зарубежных - Ki Nam Yoon, Artur Szwengiel, Hung-Tsung Wu [4, 5, 7-12, 22, 35, 42]. Существенный вклад в изучение видового состава макромицетов Томской области был сделан в конце 60-х годов прошлого столетия микологами Томского госуниверситета [13], на сегодняшний день сотрудники Томского государственного университета Н. Н. Кудашова и С. И. Гашков изучают биоразнообразие макромицетов и дополняют список коллекции грибов Томской области [13-15].
Работа была выполнена на базе НИИ ТГУ в малом инновационном предприятии «Микобакс» в 2016-2017 гг. под руководством кандидата биологических наук, доцента Ольги Борисовны Вайшля.
Объект исследования- макромицеты Томской области.
Предмет исследования- культуры Neolentinus lepideus (Fr.) Redhead & Ginns 1985, Paxillus involutus (Batsch) Fr. 1838, Suillus sibiricus (Singer) Singer 1945.
Цель данной работы - выявление фармакологически значимых макромицетов Томской области и сохранение их в коллекции in vitro.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделение чистых культур из плодовых тел макромицетов;
2. Создание списка элюатов и режимов для получения БАВ из макромицетов;
3. Оптимизация питательной среды для Neolentinus lepideus, Paxillus involutus, Suillus sibiricus;
4. Изучение динамики роста Neolentinus lepideus на жидких питательных средах путем измерения концентрации глюкозы и водорастворимого белка в культуральной жидкости.
Защищаемые положения:
1. Гриб, найденный в Лоскутовском припоселковом кедровнике, идентифицирован как Пилолистник чешуйчатый (Neolentinus lepideus);
2. С целью накопления биомассы гриба Neolentinus lepideus необходимо использовать 6-12 суточную культуру при глубинном культивировании штамма 5391;
3. Оптимальной средой культивирования Neolentinus lepideus является среда Пашевского, Paxillus involutus- среда Хагема, Suillus sibiricus- среда Худякова - Возняковской.
По материалам выпускной квалификационной работы опубликовано два материала в сборнике материалов «Старт в науку» [16, 17] и одна статья в сборнике тезисов
Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий» [18].
Автор работы выражает благодарность своему научному руководителю О.Б. Вайшля и инженеру-микробиологу ООО «Микобакс» Н.В. Шабалиной за неоценимую помощь в освоении методов культивирования макромицетов; за помощь в определении систематической принадлежности макромицетов - старшему научному сотруднику НИИББ ТГУ Н.Н. Агафоновой; старшему преподавателю кафедры Экологии и безопасности жизнедеятельности Института неразрушающего контроля ТПУ А. Г. Кагирову - за предоставление портативного спектрофотометра для исследования скорости роста жидкой культуры макромицетов.
В России описано примерно 4000 видов макромицетов, из них съедобных около 300, в Томске же используют не более 15 видов в силу низкой культуры потребления. Территория Томской области с точки зрения микологии представляет собой интересный, но еще мало исследованный район.
На сегодняшний день лекарственные грибы являются недостаточно изученными объектами. Тем не менее виды, изученные до настоящего момента, уже представляют широкий источник биологически активных веществ: антифунгальные,
противовоспалительные, противоопухолевые, антивирусные, антибактериальные, антипротозойные, регулирующие давление крови, потенцирующие сердечно-сосудистую систему, антихолестеринемические, антилипидемические, антидиабетические,
иммуномоделирующие, тонизирующие почки, гепатопротекторные, тонизирующие нервную систему, потенцирующие половую функцию. Многие фармакологически значимые макромицеты содержат в своих плодовых телах и культуральном мицелии активные полисахариды. Большое количество экспериментально и клинически доказанных исследований показывают положительный эффект биологически активных компонентов высших грибов.
Обнаруженный в Томской области гриб идентифицирован, по макропризнакам и молекулярно-генетическому методу, как пилолистик чешуйчатый (Neolentinus lepideus). Предварительные данные показывают, что данный гриб обладает противоопухолевой и антивирусной активностью. Поэтому для дальнейшего исследования лекарственных свойств данного макромицета, была проведена работа по оптимизации питательной среды и найден наиболее эффективный штамм для промышленного культивирования пилолистника чешуйчатого. Анализ роста макромицета Neolentinus lepideus позволяет заключить, что при уровне глюкозы 100 мкг/мл и ниже, происходит уменьшение среднесуточного прироста белка. С целью накопления биомассы белка эффективнее использовать 6-12 суточную культуру штамма 5391, т.к. он продемонстрировал наибольший прирост белка в культуральной жидкости при наименьшем потреблении глюкозы.
В дальнейшем планируется проведение работ по исследованию лекарственных свойств и выделению БАВ из культуральной жидкости макромицетов: Neolentinus lepideus, Paxillus involutus, Suillus sibiricus.
На сегодняшний день лекарственные грибы являются недостаточно изученными объектами. Тем не менее виды, изученные до настоящего момента, уже представляют широкий источник биологически активных веществ: антифунгальные,
противовоспалительные, противоопухолевые, антивирусные, антибактериальные, антипротозойные, регулирующие давление крови, потенцирующие сердечно-сосудистую систему, антихолестеринемические, антилипидемические, антидиабетические,
иммуномоделирующие, тонизирующие почки, гепатопротекторные, тонизирующие нервную систему, потенцирующие половую функцию. Многие фармакологически значимые макромицеты содержат в своих плодовых телах и культуральном мицелии активные полисахариды. Большое количество экспериментально и клинически доказанных исследований показывают положительный эффект биологически активных компонентов высших грибов.
Обнаруженный в Томской области гриб идентифицирован, по макропризнакам и молекулярно-генетическому методу, как пилолистик чешуйчатый (Neolentinus lepideus). Предварительные данные показывают, что данный гриб обладает противоопухолевой и антивирусной активностью. Поэтому для дальнейшего исследования лекарственных свойств данного макромицета, была проведена работа по оптимизации питательной среды и найден наиболее эффективный штамм для промышленного культивирования пилолистника чешуйчатого. Анализ роста макромицета Neolentinus lepideus позволяет заключить, что при уровне глюкозы 100 мкг/мл и ниже, происходит уменьшение среднесуточного прироста белка. С целью накопления биомассы белка эффективнее использовать 6-12 суточную культуру штамма 5391, т.к. он продемонстрировал наибольший прирост белка в культуральной жидкости при наименьшем потреблении глюкозы.
В дальнейшем планируется проведение работ по исследованию лекарственных свойств и выделению БАВ из культуральной жидкости макромицетов: Neolentinus lepideus, Paxillus involutus, Suillus sibiricus.
