ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕНОТИПА МИКРОГЛИИ НА ОСТРОЙ СТАДИИ ЛОКАЛЬНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА МОЗГА У МЫШИ
|
Аннотация 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
ВВЕДЕНИЕ 9
1 Обзор литературы 12
1.1 Нейровоспаление 12
1.1.1 Причины возникновения нейровоспаления и иммунный ответ 12
1.1.2 Ишемический инсульт - одна из причин развития нейровоспаления 13
1.1.3. Тотальная ишемия: гибель нейронов и нейровоспаление 14
1.1.4 Локальная ишемия головного мозга: гибель нейронов и нейровоспаление 14
1.2 Роль микроглии в нейровоспалении 17
1.3 Микроглия: происхождение, фенотипы, функции 18
1.3.1 Происхождение микроглии 18
1.3.2 Фенотипы микроглии 19
1.4 Arg+ микроглия, взаимодействие с нейронами 24
1.5 CD206+ микроглия, взаимодействие с нейронами 27
1. 6 ПЦР в реальном времени 28
1.6.1 Плюсы и минусы ПЦР в реальном времени 31
1.6.2 Анализ результатов ПЦР в реальном времени 32
2 Материалы и методы 35
2.1 Объект исследования 35
2.2 Моделирование локальной ишемии мозга у мышей 35
2.3 Выведение животных из эксперимента 36
2.4 Получение срезов мозга 37
2.5 Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга мыши 37
2.6 Микроскопический анализ 38
2.7 Подсчет клеток 38
2.8 Выделение и электрофорез тотальной РНК из мозга мыши 38
2.9 Очистка РНК 39
2.10 Синтез двухцепочечной кДНК 40
2.11 Осаждение кДНК 40
2.12 Выделения геномной ДНК из печени мыши 41
2.13 Подбор пар праймеров к последовательностям GAPDH, ARG-1 и ACTB 42
2.14 Подготовка к полимеразной цепной реакции в реальном времени 43
2.15 Полимеразная цепная реакция в реальном времени, ПЦР-РВ 44
2.16 Определение уровня экспрессии и статистическая обработка полученных данных
45
3. Результаты 46
3.1 Индукция локальной ишемии головного мозга у мышей 46
3.1.1 Ишемическое поражение мозга мыши через 6 часов после локальной ишемии .. 49
3.1.2 Изменение количества нейронов в ипсилатеральном полушарии мозга мыши ...50
3.1.3 Аксоны нейронов в стриатуме мозга мыши 52
3.1.4 Сравнительный анализ морфологии перикарионов нейронов в мозге мыши через
6 часов после локальной ишемии 53
3.2 Взаимная локализация нейронов и микроглии в стриатуме мозга мыши через 6
часов после локальной ишемии головного мозга 55
3.3 Выделение тотальной РНК из мозга мышей через 6 часов после локальной ишемии
головного мозга и контрольных мышей 58
3.4 Получение образцов кДНК на основе полученных образцов тотальной РНК 59
3.5 ПЦР в реальном времени 60
4. Обсуждение 64
ВЫВОД 69
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70
ПРИЛОЖЕНИЕ А 70
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 722
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7
ВВЕДЕНИЕ 9
1 Обзор литературы 12
1.1 Нейровоспаление 12
1.1.1 Причины возникновения нейровоспаления и иммунный ответ 12
1.1.2 Ишемический инсульт - одна из причин развития нейровоспаления 13
1.1.3. Тотальная ишемия: гибель нейронов и нейровоспаление 14
1.1.4 Локальная ишемия головного мозга: гибель нейронов и нейровоспаление 14
1.2 Роль микроглии в нейровоспалении 17
1.3 Микроглия: происхождение, фенотипы, функции 18
1.3.1 Происхождение микроглии 18
1.3.2 Фенотипы микроглии 19
1.4 Arg+ микроглия, взаимодействие с нейронами 24
1.5 CD206+ микроглия, взаимодействие с нейронами 27
1. 6 ПЦР в реальном времени 28
1.6.1 Плюсы и минусы ПЦР в реальном времени 31
1.6.2 Анализ результатов ПЦР в реальном времени 32
2 Материалы и методы 35
2.1 Объект исследования 35
2.2 Моделирование локальной ишемии мозга у мышей 35
2.3 Выведение животных из эксперимента 36
2.4 Получение срезов мозга 37
2.5 Иммуногистохимическое окрашивание срезов мозга мыши 37
2.6 Микроскопический анализ 38
2.7 Подсчет клеток 38
2.8 Выделение и электрофорез тотальной РНК из мозга мыши 38
2.9 Очистка РНК 39
2.10 Синтез двухцепочечной кДНК 40
2.11 Осаждение кДНК 40
2.12 Выделения геномной ДНК из печени мыши 41
2.13 Подбор пар праймеров к последовательностям GAPDH, ARG-1 и ACTB 42
2.14 Подготовка к полимеразной цепной реакции в реальном времени 43
2.15 Полимеразная цепная реакция в реальном времени, ПЦР-РВ 44
2.16 Определение уровня экспрессии и статистическая обработка полученных данных
45
3. Результаты 46
3.1 Индукция локальной ишемии головного мозга у мышей 46
3.1.1 Ишемическое поражение мозга мыши через 6 часов после локальной ишемии .. 49
3.1.2 Изменение количества нейронов в ипсилатеральном полушарии мозга мыши ...50
3.1.3 Аксоны нейронов в стриатуме мозга мыши 52
3.1.4 Сравнительный анализ морфологии перикарионов нейронов в мозге мыши через
6 часов после локальной ишемии 53
3.2 Взаимная локализация нейронов и микроглии в стриатуме мозга мыши через 6
часов после локальной ишемии головного мозга 55
3.3 Выделение тотальной РНК из мозга мышей через 6 часов после локальной ишемии
головного мозга и контрольных мышей 58
3.4 Получение образцов кДНК на основе полученных образцов тотальной РНК 59
3.5 ПЦР в реальном времени 60
4. Обсуждение 64
ВЫВОД 69
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 70
ПРИЛОЖЕНИЕ А 70
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 722
Ишемический инсульт является одной из ведущих причин смерти и инвалидности во всем мире [Johnson et al., 2016]. Ишемический инсульт вызывает нарушение
гематоэнцефалического барьера, каскады нейровоспаления и гибель нейронов, что приводит к тяжелому неврологическому дефициту [ladecola, Anrather, 2011]. Пациентов с ишемическим инсультом, которые прибыли в больницу в течение короткого промежутка времени (3-4,5 ч после инсульта) обычно лечат тромболитическим агентом - рекомбинантным тканевым активатором плазминогена и проводят тромбоэктомию, пытаясь восстановить перфузию и минимизировать повреждение головного мозга [Shichita et al., 2012 ; Jovin et al., 2015 ; Leigh et al., 2018 ; Nogueira et al., 2018 ; Albers et al., 2018]. Для пациентов, которые не успели обратиться в медицинское учреждение в течение первых часов, в настоящее время не существует безопасного и эффективного лечения [Sughrue et al., 2004, ; Feng et al., 2013]. Для разработки эффективных методов лечения этих пациентов важно понимать сложные и не полностью изученные механизмы постишемической воспалительной реакции, которая часто усиливает и обостряет ишемическое поражение [Moskowitz et al., 2010].
Решающую роль в постишемическом воспалении играют резидентная микроглия и периферические макрофаги - их мобилизация происходит в течение первого часа после поражения [Davalos et al., 2005], они же являются и основной мишенью при изучении нейровоспаления. Микроглия демонстрирует широкий спектр фенотипов, основные из них: М0 (покоящаяся микроглия) и М1/М2 (активированная микроглия). Показано, что при возникновении патологических процессов микроглия активируется, т.е. переходит из М0 фенотипа в М1/М2. Активированная микроглия может как способствовать, так и препятствовать неврологическому восстановлению после инсульта или других травм, причем в начале поражения преобладает микроглия с нейропротекторными свойствами (М2 фенотип) - имеющая повышенную фагоцитарную активность [Hickman et al., 2013] и сниженную выработку медиаторов воспаления. Она способствуют выживанию кортикальных нейронов как в нормальных, так и в ишемических/гипоксических условиях. Затем начинает преобладать провоспалительный фенотип микроглии (М1), который характеризуется пониженной фагоцитозной активностью и повышенной секрецией провоспалительных медиаторов. M1 микроглия усугубляет гибель нейронов за счет высвобождения фактора некроза опухоли-а и оксида азота, нарушает отрастание аксонов [Kigerl et al., 2009].
В ишемических условиях при активации микроглии в сторону М2 фенотипа наблюдается повышенный синтез аргиназы-1 (ARG!) [Mayer, et al., 2013 ; Mosser, Edwards, 2008 ; Hu et al., 2012].
Ген ARG1 кодирует фермент аргиназу-1, локализующуюся в цитоплазме клеток. Аргиназа-1 катализирует гидролиз L-аргинина, который служит необходимым предшественником для синтеза белков, многих биологически важных молекул (орнитин, пролин, полиамины, креатин и агматин) и, что является самым важным, он является субстратом для синтеза оксида азота (NO) [Синякин, Баталова, 2020]. NG обладает широким спектром биорегуляторных действий в низких и умеренных количествах: оказание вазодилатирующего и антитромботического действия, угнетение клеточной пролиферации, препятствие адгезии циркулирующих тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию, и др. [Якушев и др., 2012].
CD206, также известный как макрофаг-маннозный рецептор 1 (MRC1) или маннозный рецептор C-типа (MRC1), также является маркером М2 фенотипа микроглии.
CD206/MRC1 является сахарозависимым рецептором, который распознает множество лигандов, включая маннозу, фруктозу и глюкозу. Он играет важную роль в регуляции иммунной реакции, фагоцитозе и ремоделировании тканей [Microglia polarization with M1/M2 phenotype ..., 2017].
Одним из характерных маркеров М1 фенотипа микроглии является CD86. CD86 является одним из молекул, которые микроглия экспрессирует на своей поверхности для взаимодействия с рецепторами T-клеток [Modulators of microglia activation and polarization in ischemic stroke, 2020].
Из выше представленных фактов следует, что при анализе уровней экспрессии генов-маркеров М2 и М1 фенотипов микроглии, например, ARG1 или CD86, можно подтвердить наличие в очаге ишемического поражения активированной микроглии про- или противовоспалительного фенотипа.
Метод классической ПЦР не позволяет определять уровень экспрессии тех или иных генов. Однако, в настоящее время активно развиваются новые методики ПЦР, позволяющие быстро и эффективно выполнять широкий спектр научных и прикладных задач. ПЦР в реальном времени позволяет анализировать активность генов в исследуемых образцах ткани и не требует отдельной стадии визуализации результатов [Ребриков, 2009; Godfrey, Norwood et al., 2002].
Работа направлена на анализ реакции нейронов в мозге мыши на ишемическое поражение через 6 часов после индуцированной локальной ишемии головного мозга и взаимодействие нейронов и микроглии в этот период. Предполагается, что в ишемическом очаге, формирующемся на протяжении нескольких часов после ишемического поражения, находится микроглия противовоспалительного М2 фенотипа, которая способствует выживанию нейронов в ишемических / гипоксических условиях.
Исследование является актуальным в связи с важностью изучения М2-фенотипа микроглии, который способствует выживанию нейронов в ишемических / гипоксических условиях. Расширение фундаментальных знаний в данной области - наиболее перспективная цель для снижения цитотоксичности нейровоспаления.
Цель исследования: Определение фенотипа микроглии в мозге мыши на острой стадии (через 6 часов) после локальной ишемии головного мозга.
Задачи исследования:
1. Провести количественный и морфологический анализ нейронов в области ишемического очага и полутени у мышей в период острой стадии ишемического инсульта.
2. Проанализировать взаимную локализации нейронов и микроглии в области ишемического очага, полутени и контралатерального полушария у мышей в период острой стадии ишемического инсульта.
3. Провести количественный анализ уровня экспрессии маркеров фенотипов микроглии: М1 (CD86) и М2 (CD206 и ARG1").
Исследование выполнено в лаборатории нейробиологии и лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИИ ББ ТГУ.
гематоэнцефалического барьера, каскады нейровоспаления и гибель нейронов, что приводит к тяжелому неврологическому дефициту [ladecola, Anrather, 2011]. Пациентов с ишемическим инсультом, которые прибыли в больницу в течение короткого промежутка времени (3-4,5 ч после инсульта) обычно лечат тромболитическим агентом - рекомбинантным тканевым активатором плазминогена и проводят тромбоэктомию, пытаясь восстановить перфузию и минимизировать повреждение головного мозга [Shichita et al., 2012 ; Jovin et al., 2015 ; Leigh et al., 2018 ; Nogueira et al., 2018 ; Albers et al., 2018]. Для пациентов, которые не успели обратиться в медицинское учреждение в течение первых часов, в настоящее время не существует безопасного и эффективного лечения [Sughrue et al., 2004, ; Feng et al., 2013]. Для разработки эффективных методов лечения этих пациентов важно понимать сложные и не полностью изученные механизмы постишемической воспалительной реакции, которая часто усиливает и обостряет ишемическое поражение [Moskowitz et al., 2010].
Решающую роль в постишемическом воспалении играют резидентная микроглия и периферические макрофаги - их мобилизация происходит в течение первого часа после поражения [Davalos et al., 2005], они же являются и основной мишенью при изучении нейровоспаления. Микроглия демонстрирует широкий спектр фенотипов, основные из них: М0 (покоящаяся микроглия) и М1/М2 (активированная микроглия). Показано, что при возникновении патологических процессов микроглия активируется, т.е. переходит из М0 фенотипа в М1/М2. Активированная микроглия может как способствовать, так и препятствовать неврологическому восстановлению после инсульта или других травм, причем в начале поражения преобладает микроглия с нейропротекторными свойствами (М2 фенотип) - имеющая повышенную фагоцитарную активность [Hickman et al., 2013] и сниженную выработку медиаторов воспаления. Она способствуют выживанию кортикальных нейронов как в нормальных, так и в ишемических/гипоксических условиях. Затем начинает преобладать провоспалительный фенотип микроглии (М1), который характеризуется пониженной фагоцитозной активностью и повышенной секрецией провоспалительных медиаторов. M1 микроглия усугубляет гибель нейронов за счет высвобождения фактора некроза опухоли-а и оксида азота, нарушает отрастание аксонов [Kigerl et al., 2009].
В ишемических условиях при активации микроглии в сторону М2 фенотипа наблюдается повышенный синтез аргиназы-1 (ARG!) [Mayer, et al., 2013 ; Mosser, Edwards, 2008 ; Hu et al., 2012].
Ген ARG1 кодирует фермент аргиназу-1, локализующуюся в цитоплазме клеток. Аргиназа-1 катализирует гидролиз L-аргинина, который служит необходимым предшественником для синтеза белков, многих биологически важных молекул (орнитин, пролин, полиамины, креатин и агматин) и, что является самым важным, он является субстратом для синтеза оксида азота (NO) [Синякин, Баталова, 2020]. NG обладает широким спектром биорегуляторных действий в низких и умеренных количествах: оказание вазодилатирующего и антитромботического действия, угнетение клеточной пролиферации, препятствие адгезии циркулирующих тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию, и др. [Якушев и др., 2012].
CD206, также известный как макрофаг-маннозный рецептор 1 (MRC1) или маннозный рецептор C-типа (MRC1), также является маркером М2 фенотипа микроглии.
CD206/MRC1 является сахарозависимым рецептором, который распознает множество лигандов, включая маннозу, фруктозу и глюкозу. Он играет важную роль в регуляции иммунной реакции, фагоцитозе и ремоделировании тканей [Microglia polarization with M1/M2 phenotype ..., 2017].
Одним из характерных маркеров М1 фенотипа микроглии является CD86. CD86 является одним из молекул, которые микроглия экспрессирует на своей поверхности для взаимодействия с рецепторами T-клеток [Modulators of microglia activation and polarization in ischemic stroke, 2020].
Из выше представленных фактов следует, что при анализе уровней экспрессии генов-маркеров М2 и М1 фенотипов микроглии, например, ARG1 или CD86, можно подтвердить наличие в очаге ишемического поражения активированной микроглии про- или противовоспалительного фенотипа.
Метод классической ПЦР не позволяет определять уровень экспрессии тех или иных генов. Однако, в настоящее время активно развиваются новые методики ПЦР, позволяющие быстро и эффективно выполнять широкий спектр научных и прикладных задач. ПЦР в реальном времени позволяет анализировать активность генов в исследуемых образцах ткани и не требует отдельной стадии визуализации результатов [Ребриков, 2009; Godfrey, Norwood et al., 2002].
Работа направлена на анализ реакции нейронов в мозге мыши на ишемическое поражение через 6 часов после индуцированной локальной ишемии головного мозга и взаимодействие нейронов и микроглии в этот период. Предполагается, что в ишемическом очаге, формирующемся на протяжении нескольких часов после ишемического поражения, находится микроглия противовоспалительного М2 фенотипа, которая способствует выживанию нейронов в ишемических / гипоксических условиях.
Исследование является актуальным в связи с важностью изучения М2-фенотипа микроглии, который способствует выживанию нейронов в ишемических / гипоксических условиях. Расширение фундаментальных знаний в данной области - наиболее перспективная цель для снижения цитотоксичности нейровоспаления.
Цель исследования: Определение фенотипа микроглии в мозге мыши на острой стадии (через 6 часов) после локальной ишемии головного мозга.
Задачи исследования:
1. Провести количественный и морфологический анализ нейронов в области ишемического очага и полутени у мышей в период острой стадии ишемического инсульта.
2. Проанализировать взаимную локализации нейронов и микроглии в области ишемического очага, полутени и контралатерального полушария у мышей в период острой стадии ишемического инсульта.
3. Провести количественный анализ уровня экспрессии маркеров фенотипов микроглии: М1 (CD86) и М2 (CD206 и ARG1").
Исследование выполнено в лаборатории нейробиологии и лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИИ ББ ТГУ.
Ссылаясь на полученный результаты, а также на имеющиеся литературные данные, можно предположить, что простая классификация активированной на М1- и М2-фенотип может не подходить для фенотипирования микроглии после инсульта на исследуемой стадии.
Об этом позволяют судить достаточно противоречивые результаты. К примеру, вышеприведенные данные о функциональной активности исследуемой микроглии не позволяют с точностью утверждать о ее фагоцитозной активности и активном делении в зоне поражения, что может быть следствием активации микроглии по классическому провоспалительному пути (М1-фенотип).
Однако, анализ уровня экспрессии четко демонстрирует активную экспрессию маркера противовоспалительного М2-фенотипа CD206 и пониженную экспрессию М1- фенотипа.
В целом, можно сделать предположение о том, что активация микроглии - динамический процесс. В определенной временной точки на него может оказывать влияние внутренняя среда ЦНС, а также разная степень поражения ткани.
Исследуемая нами стадия является важной для дальнейшего изучения, поскольку на данной этапе не преобладает выраженного фенотипа микроглии, а следовательно, есть вероятность повлиять на течение нейродегенеративных процессов. При изучении более поздних стадий инсульта, вероятно, фенотипирование микроглии происходит более конкретно, однако степень повреждений является более критичной.
Об этом позволяют судить достаточно противоречивые результаты. К примеру, вышеприведенные данные о функциональной активности исследуемой микроглии не позволяют с точностью утверждать о ее фагоцитозной активности и активном делении в зоне поражения, что может быть следствием активации микроглии по классическому провоспалительному пути (М1-фенотип).
Однако, анализ уровня экспрессии четко демонстрирует активную экспрессию маркера противовоспалительного М2-фенотипа CD206 и пониженную экспрессию М1- фенотипа.
В целом, можно сделать предположение о том, что активация микроглии - динамический процесс. В определенной временной точки на него может оказывать влияние внутренняя среда ЦНС, а также разная степень поражения ткани.
Исследуемая нами стадия является важной для дальнейшего изучения, поскольку на данной этапе не преобладает выраженного фенотипа микроглии, а следовательно, есть вероятность повлиять на течение нейродегенеративных процессов. При изучении более поздних стадий инсульта, вероятно, фенотипирование микроглии происходит более конкретно, однако степень повреждений является более критичной.
