ВВЕДЕНИЕ 3
1. Экстремофильные микроорганизмы в экосистемах, связанных с добычей полезных ископаемых и соленых озерах 5
2. Молекулярно-биологические методы для детекции и идентификации микроорганизмов 9
2.1 Амплификация (ПЦР) 9
2.2 Гибридизация со специфическими олигонуклеотидными зондами 11
2.3 Методы молекулярного фингерпринтинга 13
2.4 Методы секвенирования и анализ метагеномов 14
3. Материалы и методы 18
4. Результаты и обсуждение 18
ВЫВОДЫ 20
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 21
Разнообразие живых организмов на Земле долгое время недооценивалось. Истинные масштабы разнообразия «приоткрылись» с развитием молекулярных методов, основанных на исследовании нуклеиновых кислот (ДНК). Они позволяют оценить разнообразие живых организмов в природном образце (метагеномика, высокопроизводительное секвенирование генов-молекулярных маркеров) и определить доминирующих представителей (методы молекулярного фингерпринтинга).
Филогенетическое и метаболическое разнообразие архей и бактерий хорошо изучено, но, несмотря на это, их характеристика далека от завершения. Недостаточны данные об эукариотической составляющей многих экосистем, особенно связанных с экстремальными факторами среды. В связи с неполной изученностью филотипов актуальны исследования, направленные на расширение знаний об экологии и физиологии этих организмов, в том числе для открытия новых областей их практического применения. Данные «молекулярного скрининга» могут быть использвованы для целенаправленного выделения и таксономического описания новых групп живых организмов.
Целью работы была молекулярная детекция доминирующих филотипов прокариот и эукариот в образцах осадков и микробных матов из экстремальных местообитаний для характеристики филогенетического разнообразия экосистем и поиска новых организмов.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделить тотальную ДНК из проб осадков и микробных матов.
2. Амплифицировать фрагменты гена 18S рРНК для эукариот и гена 16S рРНК для прокариот.
3. Разделить фрагменты в химическом денатурирующем градиенте и получить ДГГЭ-профили доминирующих микроорганизмов.
4. Идентифицировать доминирующих Eukaryota и Procaryota в исследованных пробах на основе анализа полученных последовательностей.
Автор благодарит за помощь в обсуждении результатов и планировании экспериментов доцента кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ, кандидата биологических наук Юлию Александровну Франк, а также всех сотрудников Лаборатории молекулярной биологии и биохимии.
1. Амплифицированы фрагменты генов рибосомальных РНК и получены ДГГЭ-профили доминирующих Archaea, Bacteria и Eukarya из проб осадков и микробных матов из экстремальных местообитаний.
2. В осадках и микробных матах, связанных с добычей каменного угля в Новосибирской обл. и Кузбассе, доминируют аммоний-окисляющие и метанобразующие археи. Среди бактериальных филотипов большинство относятся к цианобактериям (Synechococcales). Детектированные Eukaryota представлены грибами, споровиками и зелеными водорослями.
3. Из проб осадков, ассоциированных с добычей полиметаллических руд в Алтайском крае, были аплифицированы только фрагменты гена 16S рРНК Archaea. Все найденные филотипы принадлежат к филуму Thaumarchaeota и близки к Nitrososphaera viennensis с разной степенью гомологии частичной последовательности гена (87-96%).
4. В солёных озёрах Алтая преобладают галофильные Euryarchaeota. При амплификации и разделении фрагментов гена 16S рРНК бактерий были обнаружены филотипы, родственные Salinibacter ruber (99% гомологии частичной последовательности). Среди Eukarya преобладают зеленые микроводоросли.
5. Во всех исследованных местообитаниях обнаружены организмы,
филогенетически удаленные от валидно описанных представителей. Следовательно, изученные экосистемы служат перспективными
источниками для выделения новых организмов и их таксономического описания.
