АННОТАЦИЯ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 6
1.1 Оогенез у двукрылых насекомых, мероистические яичники политрофного типа 6
1.2 Строение овариолы: гермарий и вителлярий 7
1.2.1 Ранний оогенез в гермарии 8
1.2.2 Развитие яйцевых камер 10
1.2.3 Гибель питающих клеток на поздних стадиях оогенеза 10
1.3 Питающие клетки - строение и функции 12
1.3.1 Хроматин питающих клеток: политения - эндомитоз - полиплоидия 12
1.3.2 Пространственная организация хромосом в питающих клетках 13
1.3.3 Роль ядрышка в пространственной организации хроматина питающих клеток 15
1.4 Организация кластеров рДНК, ядрышковый организатор 15
1.4.1 Амплификация генов рРНК и образование экстрахромосомных копий генов 17
1.4.2 Экстрахромосомные кольцевые молекулы рДНК 17
1.4.3 Модели образования экстрахромосомных кольцевых молекул рДНК 18
1.4.4 Методы выявления экстрахромосомных кольцевых молекул рДНК 20
2 Материалы и методы 23
2.1 Объект исследования 23
2.1.1 Отлов и культивирование Protophormia terraenovae 23
2.1.2 Фиксация ткани 23
2.2 Выделение ДНК 23
2.2.1 Измерение концентрации выделенной тотальной ДНК 23
1.2.2 Обработка тотальной ДНК экзонуклеазой RecBCD 23
2.2.3 Электрофорез тотальной ДНК в агарозном геле 24
2.3 2D гель-электрофорез 24
2.4 Гибридизация по Саузерну 24
2.5 Получение ДНК зондов для гибридизации на нитроцеллюлозном фильтре 25
2.5.1 Амплификация 18S рДНК 25
2.5.3 Зонд на тотальную ДНК 26
2.6 Гибридизация на нейлоновой мембране 27
2.6.1 Гибридизация 27
2.6.2 Процедура детекции 28
2.7 3D флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) 28
1.7.1 Получение ДНК-зонда меченного TAMRA на 18s рДНК 28
1.7.2 Получение ДНК-зонда меченного TAMRA на 5s рДНК 29
2.7.3 3D флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с ДНК-зондом на 18s рДНК и 5s
рДНК 30
2.7.4 Микроскопирование 30
2.7.5 Анализ размеров ядер питающих клеток 30
2.7.6 Анализ результатов 3D FISH в программе AxioVision Rel 4.7 31
2.7.7 Анализ результатов 3D FISH в программе ImageJ 31
3 Результаты 32
3.1 Изменение организации хроматина в ядрах трофоцитов Protophormia terraenovae....32
3.2 Локализация локусов 18S рДНК и 5S рДНК в ядрах трофоцитов яичников у P.
terraenovae методом 3D FISH на разных стадиях оогенеза 33
3.2.1 Внутриядерная локализация локусов 18S рДНК и 5S рДНК 33
3.2.2 Внутриядрышковая локализация локусов рДНК 37
3.3 Вклад ДНК ядрышкового организатора в общий объём ядра при увеличении
плоидности ядер трофоцитов 38
3.4 Определение конформации рДНК, входящей в ядрышкообразующий район, в
трофоцитах яичников Protophormia terraenovae на разных стадиях оогенеза 41
4 Обсуждение 47
ВЫВОДЫ 51
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 52
В процессе оогенеза в ядрах питающих клеток яичников двукрылых насекомых происходит реорганизация хромосом от диплоидного состояния к политенным хромосомам и через стадию эндометафазных хромосом к полиплоидной структуре ядра с множеством олиготенных фибрилл. Эти изменения сопровождаются усилением транскрипционной активности клеток, одним из главных продуктов которых является производство для ооцита огромного количества рибосом, для образования которых в ядрах формируется большое количество ядрышек. Изменение количества и объема ядрышек вносит существенный вклад в динамику пространственной организации ядер питающих клеток. Исследование направлено на изучение динамики трехмерной организации полиплоидных ядер, связанной с увеличением транскрипционной активности клеток. Исследование проводится для подтверждения гипотезы, что многочисленные ядрышки, формирующиеся на средних стадиях оогенеза в ядрах питающих клеток Protophormia terraenovae, образуются вокруг скоплений экстрахромосомных копий рДНК.
Актуальность исследования определяется отсутствием информации о возможных механизмах образования ядрышек и важностью изучения образования и динамики ядрышек в высокополиплоидных ядрах для понимания фундаментальных основ пространственной организации генетического материала в дифференцированных клетках.
Цель: изучить локализацию и конформацию рДНК в ядрах трофоцитов яичников Protophormia terraenovae (R-D) (Diptera: Calliphoridae) на разных стадиях оогенеза.
Задачи:
1. Локализовать локусы 18S и 5S рДНК в ядрах трофоцитов на разных стадиях оогенеза с помощью метода 3D флуоресцентной in situ гибридизации (3D FISH).
2. Определить вклад ДНК ядрышкового организатора в общий объём ядра при увеличении плоидности ядер трофоцитов.
3. Проверить гипотезу о присутствии в ядрах трофоцитов экстрахромосомных кольцевых копий рДНК, используя метод 2D гель-электрофореза.
Работа выполнена на базе лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды НИИ ББ ТГУ.
1. У Protophormia terraenovae в ядрах трофоцитов при переходе от политенной к полиплоидной организации хроматина, происходит перераспределение рДНК ядрышкового организатора из локальной области по всему пространству ядра. Перераспределение и увеличение локусов 5S рДНК в локальном сегменте ядра подтверждает предположение о сохранении хромосомных территорий при увеличении плоидности.
2. При полиплоидизации происходит увеличение объёма ядра и синхронное увеличение объема областей, занимаемых рДНК ядрышкового организатора, что говорит об отсутствии избыточной амплификации рДНК в ядрах трофоцитах в среднем оогенезе у Protophormia terraenovae.
3. Полученные c помощью 2D гель-электрофореза результаты не подтверждают гипотезу о том, что многочисленные ядрышки, формирующиеся в среднем оогенезе в ядрах трофоцитов Protophormia terraenovae, образуются вокруг скоплений экстрахромосомных кольцевых копий рДНК.
