СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Рекомбинантные белки 6
1.2. Системы экспрессии 7
1.2.1 Прокариотические системы экспрессии 7
1.2.2. Эукариотические системы экспрессии 9
1.2.3 Бесклеточные системы экспрессии 12
1.2.4 Преимущества лактобактерий в качестве систем экспрессии и наработки
рекомбинантных белков 12
1.3. История экспрессии генов рекомбинантных белков в бациллах 13
1.3.1 Плазмиды широкого круга хозяев 13
1.3.2 Экспрессия генов рекомбинантных белков в Bacillus subtilis 15
1.3.3 Современные системы для экспрессии генов рекомбинантных белков в
лактобациллах 15
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19
2.1 Материалы 19
2.2 Методы 20
2.2.1 Клонирование гена флуоресцентного белка mOrange pBE-S in silico 20
2.2.2 Клонирование гена флуоресцентного белка mOrange в плазмиду pBE-S 20
2.2.3 Трансформация клеток Bacillus subtilis 23
2.2.4 Гель-электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) 23
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 25
4 ВЫВОДЫ 31
5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 32
Белки выполняют широкий спектр биологических функций в организме от структурной и каталитической до сигнальной и моторной. Такая полифункциональность позволила использовать белки в многих сферах, таких как пищевая и химическая промышленность, медицина, биотехнологии и т.д. Однако во многих случаях нужный белок встречается в природе в недостаточном количестве, либо не продуцируется клетками вообще. Соответственно, возникает необходимость в производстве рекомбинантного белка в крупных масштабах.
Важным способом получения большого количества специфического белка является технология рекомбинантной ДНК, которая предполагает использование генетической рекомбинации для объединения генетического материала из нескольких источников, создавая последовательности ДНК, которые естественным образом не встречаются в геноме. Белки, полученные с помощью такой технологии, называются рекомбинантными (https://www.cusabio.com/c-20679.html).
Рекомбинантные белки позволяют развивать методики терапии различных заболеваний, таких как сахарный диабет (Chen Luo et al. 2016), гемофилия (Liras et al, 2008; Soon Ki Kim et al, 2018), анемии (Cody J. D. et al, 2016.) и различных видов рака (колоректальный рак, рак молочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря) (Michael H. et al, 2013; Cody S. Lee et al, 2017). Растёт потребность в рекомбинантных составах для их терапевтического применения (Алиев Т.К. и др. 2016).
Рекомбинантные белки могут быть использованы для локализации продуктов конкретного гена и понимания механизмов межклеточных взаимодействий.
Важную роль играют рекомбинантные белки в пищевой промышленности, т.к. могут изменять характеристики пищевых продуктов, улучшать их потребительские свойства (Гришин Д. В. и др., 2017.).
Ещё одним направлением использования рекомбинантных белков является разработка вакцин. Различные мукозальные (Wells, J. M. et al, 1995; Киселев В. И. и др., 2008) и рекомбинантные (Marc P. Girard et al, 2018) вакцины применяют для терапии таких заболеваний как вирус иммунодефицита человека и вирус папилломы человека.
Для получения рекомбинантного белка необходимы специальные системы, в которых он будет нарабатываться. Выбор системы клонирования и экспрессии целевых генов зависит от свойств целевого белка и способности клетки-хозяина продуцировать белок нужного качества при соблюдении минимального набора требований.
Молочнокислые бактерии набирают все больший интерес в качестве организмов- хозяев для экспрессии генов рекомбинантных белков, что способствует все более частому их использованию в сфере биотехнологий и фармакологии. Преимущество использования молочнокислых бактерий состоит в их GRAS-статусе и food-grade свойствах, что расширяет границы применения Lactobacillus при использовании их как системы для наработки рекомбинантных белков.
Несмотря на растущую популярность, молочнокислые бактерии являются не самым распространённым объектом в генной инженерии. Поэтому для планирования системы клонирования и экспрессии целевых генов в Lactobacillus, в качестве модели использовали Bacillus subtilis, т.к. эти организмы филогенетически ближе всего к Lactobacillus и уже использовались в качестве систем для наработки рекомбинантных белков.
Таким образом целью данного исследования являлась оценка экспрессии гена рекомбинантного белка в клетках Bacillus subtilis.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Получение плазмидного клона гена белка mOrange для дальнейшей экспрессии в Bacillus subtilis.
2. Трансформация клеток Bacillus subtilis RIK 1285 плазмидными клонами гена белка mOrange.
Работа выполнена на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины CO РАН в Лаборатории фармакогеномики под руководительством кандидата биологических наук, главного научного сотрудника Филипенко Максима Леонидовича. Автор выражает благодарность научному руководителю за помощь при написании выпускной квалификационной работы.
1. Была сконструирована модельная плазмидная конструкция pBE-S-mOrange на основе челночного вектора pBE-S для наработки белка mOrange в Bacillus subtilis.
2. Была проведена пробная наработка белка mOrange в Bacillus subtilis RIK 1285. Присутствие рекомбинантного белок mOrange после наработки не было показано.
