ВВЕДЕНИЕ 4
1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ 6
1.1. Культуры клеток растений как биологические модели 7
1.1.1. Основные принципы культивирования растительного материала
in vitro 10
1.1.2. Получение каллуса и его культивирование 13
1.2. Клеточные культуры как источник вторичных метаболитов 17
1.2.1. Экдистероиды в растении 19
2. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ 22
2.1. Объект исследований 22
2.2. Методики исследований 24
2.2.1. Приготовление питательной среды 24
2.2.2. Получение стерильной посуды 25
2.2.3. Работа в ламинарном боксе 25
2.2.4. Метод получения стерильных проростков 26
2.2.5. Метод индукции каллусогенеза 27
2.2.6. Метод пассирования клеточной культуры 28
2.2.7. Метод количественного определения экдистерона 28
2.2.8. Метод количественного определения флавоноидов 30
2.2.9. Метод фиксации клеточной культуры 31
3. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ГОРМОНОВ И ЭКДИСТЕРОНА НА РОСТ И ВТОРИЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ LYCHNIS CHALCEDONICA В УСЛОВИЯХ IN VITRO 33
3.1. Индукция и регуляция каллусогенеза L. chalcedonica in vitro 33
3.1.1. Подбор условий стерилизация семян L. chalcedonica 33
3.1.2. Подбор среды для проращивания семян L. chalcedonica 34
3.1.3. Получение каллусной ткани L. chalcedonica
и ее поддержание 35
3.2. Рост клеточной культуры в зависимости от
концентрации экдистерона 37
3.3. Влияние экзогенного экдистерона на содержание эндогенного
экдистерона в клеточной культуре L. chalcedonica 40
3.4. Влияние экзогенного экдистерона на содержание флавоноидов
в клеточной культуре L. chalcedonica 41
ВЫВОДЫ 43
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 44
В настоящее время в фармакологии получают широкое распространение препараты растительного происхождения, поскольку именно растения имеют часто невоспроизводимый по качественному составу набор биологически активных веществ (БАВ), а так же имеют ряд преимуществ по сравнению с синтетическими препаратами: хорошую переносимость, редкое развитие аллергических реакций и побочных эффектов (Сергалиева и др., 2015). Спрос на лекарственные препараты из растительного сырья привел к снижению разнообразия диких видов лекарственных растений. Одним из путей решения проблем сохранения растительных ресурсов и получения БАВ является биотехнологический способ воспроизводства растений - культуры растительных клеток. Интерес к культуре in vitro также вызван потребностью в удобной модельной системе для изучения ростовых и метаболических клеточных процессов.
Lychnis chalcedonica L. из семейства Caryophyllaceae, является ценным лекарственным растением, содержащим фитоэкдистероиды, сапонины, флавоноиды и фенольные соединения, что служило основой для введения этого вида в культуру in vitro.
Биологически активные вещества L. chalcedonica являются основой для комплексного препарата анаболического, противогрибкового, противосклеротического, радиопротекторного, иммуностимулирующего, гемореологического и противоопухолевого действий (Зибарева, 1995). Все это увеличивает интерес к данному виду и служит основанием для его введения в клеточную культуру in vitro. В настоящее время недостаточно сведений о физиологической роли экдистероидов в жизнедеятельности растений (Lafont, 2003; Головацкая, 2004).
В связи с этим целью исследования стало изучение влияния экзогенных гормонов и экдистерона на рост и вторичный метаболизм клеточной культуры Lychnis chalcedonica в условиях in vitro.
В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи: 1) индукция каллусогенеза и получение стабильной культуры (подбор оптимального способа стерилизации семян L. chalcedonica и оптимальной питательной среды для активации каллусогенеза и продолжительного культивирования культуры L. chalcedonica}; 2) изучить рост и морфологию клеточной культуры в зависимости от концентрации экзогенного экдистерона в среде, 3) изучить влияние экзогенного экдистерона на содержание эндогенного экдистерона в клеточной культуре L. chalcedonica, 4) изучить влияние экзогенного экдистерона на содержание флавоноидов в клеточной культуре L. chalcedonica.
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и биоинженерии при кафедре физиологии растений и биотехнологии Биологического института НИ ТГУ.
Результаты работы опубликованы в материалах LXV научной студенческой конференции Биологического института ТГУ «Старт в науку» 2017 г. по направлению физиология растений и биотехнология, в материалах Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы картофелеводства: фундаментальные и прикладные аспекты» 10-13 апреля 2018 г. и сборнике научных статей «Фенольные соединения: функциональная роль в растениях» по материалам X Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 14-19 мая 2018. В настоящее время 1 материалы сданы для представления на XI Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (23-27 сентября 2018 года, г. Минск, Республика Беларусь).
Автор выражает благодарность научному руководителю профессору, доктору биологических наук И. Ф. Головацкой за помощь в выполнении работы, консультанту Ю.В. Медведевой за полезные рекомендации и предоставленный материал, а также Е.В. Бойко за помощь в освоении методик исследования.
1) В ходе исследований нами индуцирован каллусогенез и получена стабильная клеточная культура. Оптимальными условиями стерилизации семян (лучшая асептика) L. chalcedonica является их тройная обработка, включающая обработку концентрированным раствором «Белизна-3», смесью перекиси и этилового спирта и УФ-А. Для индукции каллусогенеза и поддержания дальнейшего культивирования L. chalcedonica оптимальным было соотношение 4/1 ауксинов и цитокининов в питательной среде.
2) Обнаружили, что добавление экдистерона в среду увеличивало интенсивность ростовых процессов. При действии высокой концентрации экдистерона увеличивалось содержание воды и сухого вещества соответственно на 21 и 13% по сравнению с контролем.
3) Действие экдистерона в более высокой концентрации увеличило его эндогенное содержание на 47% относительно контроля.
4) Установлено, что экзогенный экдистерон, активируя рост клеточной культуры, не изменяет интенсивность метаболизма флавоноидов.
