ВЫДЕЛЕНИЕ ГРИБОВ ИЗ ХВОСТОХРАНИЛИЩА ВОЛЬФРАМОВО-МОЛИБДЕНОВОЙ ФАБРИКИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ УСТОЙЧИВОСТИ К ВЫСОКИМ КОНЦЕНТРАЦИЯМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И pH
|
ВВЕДЕНИЕ 3
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Биоразнообразие экстремофильных эукариотических микроорганизмов 6
1.1.1 Современная систематика грибов 8
1.1.2 Молекулярно-генетические методы установления видовой
принадлежности грибов 10
1.2 Механизмы устойчивости к тяжелым металлам и металлоидам у
микромицетов 11
1.2.1 Механизмы устойчивости к меди 14
1.2.2 Механизмы устойчивости к цинку 15
1.2.3 Механизмы устойчивости к молибдену 16
1.2.4 Механизмы устойчивости к мышьяку 16
1.2.5 Механизмы устойчивости к кадмию 17
1.2.6 Механизмы устойчивости к кобальту 17
1.3 Использование мицелиальных эукариот в биогеотехнологиях 18
1.3.1 Использование в биоремедиации 18
1.3.2 Использование в биовыщелачивании 19
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 21
2.1 Приготовление сред Error! Bookmark not defined.
2.2 Методика выделения чистой культуры Error! Bookmark not defined.
2.3 Приготовление рабочих концентраций тяжелых металлов Error!
Bookmark not defined.
2.4 Определение рН среды
2.5 Методика выделения ДНК
2.5.1 Выделение тотальной ДНК
2.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации полного
гена188 рРНК эукариот Error! Bookmark not defined.
2.5.3 ПЦР для амплификации фрагмента гена188 рРНК Error! Bookmark not defined.
2.5.4 Детекция результатов ПЦР
2.6 Обработка данных
3 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
3.1 Объект исследования
3.2 Выделение чистой культуры из образца А1-4
defined.
3.3 Установление устойчивости к тяжелым металлам и металлоидам у
выделенных культур Error! Bookmark not defined.
3.4 Установление устойчивости к низким значениям рН Error! Bookmark not defined.
3.5 Определение видовой принадлежности Error! Bookmark not defined.
ВЫВОДЫ 23
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 24
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Биоразнообразие экстремофильных эукариотических микроорганизмов 6
1.1.1 Современная систематика грибов 8
1.1.2 Молекулярно-генетические методы установления видовой
принадлежности грибов 10
1.2 Механизмы устойчивости к тяжелым металлам и металлоидам у
микромицетов 11
1.2.1 Механизмы устойчивости к меди 14
1.2.2 Механизмы устойчивости к цинку 15
1.2.3 Механизмы устойчивости к молибдену 16
1.2.4 Механизмы устойчивости к мышьяку 16
1.2.5 Механизмы устойчивости к кадмию 17
1.2.6 Механизмы устойчивости к кобальту 17
1.3 Использование мицелиальных эукариот в биогеотехнологиях 18
1.3.1 Использование в биоремедиации 18
1.3.2 Использование в биовыщелачивании 19
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 21
2.1 Приготовление сред Error! Bookmark not defined.
2.2 Методика выделения чистой культуры Error! Bookmark not defined.
2.3 Приготовление рабочих концентраций тяжелых металлов Error!
Bookmark not defined.
2.4 Определение рН среды
2.5 Методика выделения ДНК
2.5.1 Выделение тотальной ДНК
2.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации полного
гена188 рРНК эукариот Error! Bookmark not defined.
2.5.3 ПЦР для амплификации фрагмента гена188 рРНК Error! Bookmark not defined.
2.5.4 Детекция результатов ПЦР
2.6 Обработка данных
3 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
3.1 Объект исследования
3.2 Выделение чистой культуры из образца А1-4
defined.
3.3 Установление устойчивости к тяжелым металлам и металлоидам у
выделенных культур Error! Bookmark not defined.
3.4 Установление устойчивости к низким значениям рН Error! Bookmark not defined.
3.5 Определение видовой принадлежности Error! Bookmark not defined.
ВЫВОДЫ 23
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 24
Постоянное исследование Земли привело к открытию жизни в условиях, которые ранее считались непригодными для проживания. Например,
кипящих источниках Йеллоустоуна, в замороженных
пустынях Антарктиды, в кислых шахтных дренажах при значении pH ниже 1, а также в ионизирующих полях в ядерных реакторах. Обнаруживаются микроорганизмы, которым для нормального функционирования требуются растворы, насыщенные солями, некоторые обитают в глубине океанов и требуют от 500 до 1000 баров гидростатического давления для нормальной жизнедеятельности (Dumorne et al., 2017). Существуют стратегии, которые позволяют выживать организмам, даже не смотря на экстремальные физические и химические свойства окружающей среды. Чтобы выживать в подобных местообитаниях, организмы могут использовать специфические адаптации, которые позволяют им выдерживать замораживание, обезвоживание, голодание, высокие уровни радиационного облучения, а также другие физические или химические изменения. На сегодняшний день ученые пытаются определить пределы их роста и выживания и понять молекулярные механизмы, которые определяют эти пределы. Биохимические исследования также позволят выявить особенности, присущие биомолекулам и биополимерам, которые определяют физико-химические пределы жизни в экстремальных условиях. Расширение наших знаний о различных средах на Земле, которые являются обитаемыми для микроорганизмов и об их адаптациях к этим местообитаниям, будет иметь решающее значение для понимания того, как могла зародиться жизнь (Aguilera, 2013).
Биохимически все клетки состоят из главных биоэлементов, включая неметаллы C, H, O, N, P, S и четыре металла Na, K, Mg и Ca. Из этих элементов построены макромолекулы и метаболиты. Они формируют концентрационный градиент и стабилизируют биологические мембраны. Вместе с макроэлементами в состав клеток входят микроэлементы, среди которых особую роль играют переходные металлы. Они жизненно необходимы в низких концентрациях, но токсичны в высоких.
Изучение экстремальных условий окружающей среды и их эндемиков имеет несколько причин: 1) современные экстремальные условия, как полагают, отражают условия жизни на ранней Земле, которые сохранялись на протяжении большей части жизни планеты; 2) в условиях экстремальной окружающей среды могут обитать организмы, которые производят коммерчески важные ферменты и клеточные продукты (т.е. термостабильные ДНК полимеразы или термостабильные протеазы) (Aguilera et al., 2007).
В связи с развитием горнодобывающей промышленности и, как следствие, образованием кислых шахтных вод, стали формироваться местообитания антропогенного происхождения, характеризующиеся экстремально низким значением pH и высокой концентрацией ионов тяжелых металлов. До последнего времени в подобных местообитаниях обнаруживали прокариотические микроорганизмы, однако, в настоящее время известны эукариотические микроорганизмы, которые способны также выдерживать экстремальные условия данных экосистем (Amaral-Zettler et al., 2002).
Устойчивые к переходным металлам организмы характеризуются гомеостазом катионов, который включает вторичную транспортную систему. Вторичная транспортная система противодействует проникновению катионов в цитоплазму и удаляет избыток ионов металлов из клетки.
В настоящее время активное изучение эукариотического биоразнообразия экстремофильных микроорганизмов, характеризующихся низкими значениями pH и высокими концентрациями тяжелых металлов (Cd2+, Hg2+, Cu2+ и др.), показало присутствие видов микромицетов, преимущественно относящихся к Ascomycota. Экстремофильные мицелиальные эукариоты подобных мест обитания характеризуются наличием хорошо развитой системы металлотионеинов, обладающих высокой селективностью по отношению к отдельным переходным металлам, а также способностью к компартментализации избытка тяжелых металлов.
Исследование биоразнообразия экстремофилов стало актуальным в связи с развитием биотехнологий: биовыщелачивание значимых переходных металлов, биоремедиация сточных вод и загрязненных территорий. Также эукариотические экстремофильные микроорганизмы характеризуются наличием генетического потенциала для создания генномодифицированных сельскохозяйственных культур, устойчивых к различным неблагоприятным экологическим факторам (Cardenas et al., 2010).
В связи с этим, целью работы стало выделение и изучение эукариотических микроорганизмов из экстремальных местообитаний. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: получить чистую культуру мицелиальных микроорганизмов из пробы Al-4; определить устойчивость к высоким концентрациям тяжелых металлов и низким значениям pH; идентифицировать видовую принадлежность выделенных штаммов по последовательности гена 18S rRNA и региона ITS.
Работа проводилась в лаборатории биохимии и молекулярной биологии Научно-исследовательского института биологии и биофизики Томского государственного университета (ТГУ).
Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям: профессору, доктору биологических наук Ольге Викторовне Карначук и аспиранту Евгению Владимировичу Плотникову за внимание, научное руководство и консультации в постановке экспериментов, магистранту 1 года Ильюшину Вадиму за предоставленные данные по молекулярным исследованиям. А также глубокую признательность всему коллективу кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ.
кипящих источниках Йеллоустоуна, в замороженных
пустынях Антарктиды, в кислых шахтных дренажах при значении pH ниже 1, а также в ионизирующих полях в ядерных реакторах. Обнаруживаются микроорганизмы, которым для нормального функционирования требуются растворы, насыщенные солями, некоторые обитают в глубине океанов и требуют от 500 до 1000 баров гидростатического давления для нормальной жизнедеятельности (Dumorne et al., 2017). Существуют стратегии, которые позволяют выживать организмам, даже не смотря на экстремальные физические и химические свойства окружающей среды. Чтобы выживать в подобных местообитаниях, организмы могут использовать специфические адаптации, которые позволяют им выдерживать замораживание, обезвоживание, голодание, высокие уровни радиационного облучения, а также другие физические или химические изменения. На сегодняшний день ученые пытаются определить пределы их роста и выживания и понять молекулярные механизмы, которые определяют эти пределы. Биохимические исследования также позволят выявить особенности, присущие биомолекулам и биополимерам, которые определяют физико-химические пределы жизни в экстремальных условиях. Расширение наших знаний о различных средах на Земле, которые являются обитаемыми для микроорганизмов и об их адаптациях к этим местообитаниям, будет иметь решающее значение для понимания того, как могла зародиться жизнь (Aguilera, 2013).
Биохимически все клетки состоят из главных биоэлементов, включая неметаллы C, H, O, N, P, S и четыре металла Na, K, Mg и Ca. Из этих элементов построены макромолекулы и метаболиты. Они формируют концентрационный градиент и стабилизируют биологические мембраны. Вместе с макроэлементами в состав клеток входят микроэлементы, среди которых особую роль играют переходные металлы. Они жизненно необходимы в низких концентрациях, но токсичны в высоких.
Изучение экстремальных условий окружающей среды и их эндемиков имеет несколько причин: 1) современные экстремальные условия, как полагают, отражают условия жизни на ранней Земле, которые сохранялись на протяжении большей части жизни планеты; 2) в условиях экстремальной окружающей среды могут обитать организмы, которые производят коммерчески важные ферменты и клеточные продукты (т.е. термостабильные ДНК полимеразы или термостабильные протеазы) (Aguilera et al., 2007).
В связи с развитием горнодобывающей промышленности и, как следствие, образованием кислых шахтных вод, стали формироваться местообитания антропогенного происхождения, характеризующиеся экстремально низким значением pH и высокой концентрацией ионов тяжелых металлов. До последнего времени в подобных местообитаниях обнаруживали прокариотические микроорганизмы, однако, в настоящее время известны эукариотические микроорганизмы, которые способны также выдерживать экстремальные условия данных экосистем (Amaral-Zettler et al., 2002).
Устойчивые к переходным металлам организмы характеризуются гомеостазом катионов, который включает вторичную транспортную систему. Вторичная транспортная система противодействует проникновению катионов в цитоплазму и удаляет избыток ионов металлов из клетки.
В настоящее время активное изучение эукариотического биоразнообразия экстремофильных микроорганизмов, характеризующихся низкими значениями pH и высокими концентрациями тяжелых металлов (Cd2+, Hg2+, Cu2+ и др.), показало присутствие видов микромицетов, преимущественно относящихся к Ascomycota. Экстремофильные мицелиальные эукариоты подобных мест обитания характеризуются наличием хорошо развитой системы металлотионеинов, обладающих высокой селективностью по отношению к отдельным переходным металлам, а также способностью к компартментализации избытка тяжелых металлов.
Исследование биоразнообразия экстремофилов стало актуальным в связи с развитием биотехнологий: биовыщелачивание значимых переходных металлов, биоремедиация сточных вод и загрязненных территорий. Также эукариотические экстремофильные микроорганизмы характеризуются наличием генетического потенциала для создания генномодифицированных сельскохозяйственных культур, устойчивых к различным неблагоприятным экологическим факторам (Cardenas et al., 2010).
В связи с этим, целью работы стало выделение и изучение эукариотических микроорганизмов из экстремальных местообитаний. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: получить чистую культуру мицелиальных микроорганизмов из пробы Al-4; определить устойчивость к высоким концентрациям тяжелых металлов и низким значениям pH; идентифицировать видовую принадлежность выделенных штаммов по последовательности гена 18S rRNA и региона ITS.
Работа проводилась в лаборатории биохимии и молекулярной биологии Научно-исследовательского института биологии и биофизики Томского государственного университета (ТГУ).
Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям: профессору, доктору биологических наук Ольге Викторовне Карначук и аспиранту Евгению Владимировичу Плотникову за внимание, научное руководство и консультации в постановке экспериментов, магистранту 1 года Ильюшину Вадиму за предоставленные данные по молекулярным исследованиям. А также глубокую признательность всему коллективу кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ.
1. Из пробы Al-4 были выделены в чистую культуру штаммы мицелиальных эукариот АФ1, АФ2, АФ3, АФ4.
2. Все штаммы проявили резистентность к высоким концентрациям тяжелых металлов Zn2+ (6 г/л), Cu2+ (6 г/л), Mo6+ (6 г/л), As3- (5г/л), Cd2+ (6 г/л). Кобальт подавлял рост мицелия в концентрации 2 г/л. Рост мицелия наблюдали на pH 2 у АФ1, АФ3 и рН 3 у АФ1, АФ2, АФ3. Штамм АФ4 нуждается в дополнительных исследованиях.
3. На основании последовательности гена 18S рРНК и региона ITS было установлено, что штамм АФ1 принадлежит к аскомицету Penicillium ochrochloron (100% гомология), штамм АФ3 к аскомицету Acidea extrema (100% гомология), штамм АФ4 к базидиомицету Rhodosporidium toruloides (100% гомология).
4. Штамм АФ3, принадлежащий Acidea extrema, представляет особый интерес, так как этот представитель был описан единожды группой исследователей из Чехии (Hujslova et al., 2014). Планируется дальнейшее изучение этого штамма.
2. Все штаммы проявили резистентность к высоким концентрациям тяжелых металлов Zn2+ (6 г/л), Cu2+ (6 г/л), Mo6+ (6 г/л), As3- (5г/л), Cd2+ (6 г/л). Кобальт подавлял рост мицелия в концентрации 2 г/л. Рост мицелия наблюдали на pH 2 у АФ1, АФ3 и рН 3 у АФ1, АФ2, АФ3. Штамм АФ4 нуждается в дополнительных исследованиях.
3. На основании последовательности гена 18S рРНК и региона ITS было установлено, что штамм АФ1 принадлежит к аскомицету Penicillium ochrochloron (100% гомология), штамм АФ3 к аскомицету Acidea extrema (100% гомология), штамм АФ4 к базидиомицету Rhodosporidium toruloides (100% гомология).
4. Штамм АФ3, принадлежащий Acidea extrema, представляет особый интерес, так как этот представитель был описан единожды группой исследователей из Чехии (Hujslova et al., 2014). Планируется дальнейшее изучение этого штамма.
