МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МИКРОБИОМА КЛЕЩЕЙ IXODES PERSULCATUS И I. РА VLOVSKYI ГОРОДА ТОМСКА
|
АННОТАЦИЯ 4
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Клещи - переносчики опасных заболеваний человека и животных 7
1.2 Микробиом иксодовых клещей 10
1.3 Состав микробиоты на поверхности тела клещей 17
1.4 Состав микробиоты различных органов клещей 17
1.5 Симбиотические бактерии, способствующие закреплению патогена в организме клеща 19
1.6 Симбиотические бактерии, препятствующие закреплению патогена в организме клеща 20
1.7 Реакции иммунной системы клещей на попадание в них патогенных возбудителей 20
1.9 Этапы, приводящие к успешной колонизации микроорганизмами кишечника
иксодовых клещей 23
1.10 Функциональная роль микробиома клещей 25
1.13 Методы изучения разнообразия микроорганизмов 28
2 Материалы и методы 32
2.1 Отлов клещей и изготовление фиксированных образцов 32
2.2 Выделение геномной ДНК из фиксированного материала клещей видов I. persulcatus и I. pavlovskyi фенол-хлороформным методом 33
2.3 Определение концентрации и качества ДНК с помощью спектрофотометра 35
2.6 Проведение ПЦР с праймерами на генетический материал Borrelia burgdorferi 35
2.4 Постановка электрофореза в агарозном геле 36
2.5 Подготовка библиотеки ДНК для секвенирования на MinlON (Oxford Nanopore
Technologies) 36
2.6 Очистка ДНК библиотеки для секвенирования на MinlON (Oxford Nanopore
Technologies) 37
2.7 Оценка концентрации ДНК-библиотеки после очистки с помощью флуориметра....38
2.8 Подготовка библиотеки для секвенирования и запуск секвенирования на MinION (Oxford Nanopore Technologies) 38
3 Результаты и обсуждение 40
3.1 Отлов иксодовых клещей, определение их видов и фиксация биологического материала 40
3.2 Выделение ДНК фенол-хлороформным методом из кишечников и тел без кишечников клещей 40
3.3 Анализ полученных образцов ДНК тел клещей без кишечников на генетический материал Borrelia spp 44
3.4 Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование при помощи MinION (Oxford
Nanopore Technologies) 46
3.5 Биоинформатическая и статистическая обработка данных секвенирования 50
3.6 Оценка биоразнообразия микробиомов клещей видов I. persulcatus и I. pavlovskyi и их частей тела 54
ВЫВОДЫ 57
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 58
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 Клещи - переносчики опасных заболеваний человека и животных 7
1.2 Микробиом иксодовых клещей 10
1.3 Состав микробиоты на поверхности тела клещей 17
1.4 Состав микробиоты различных органов клещей 17
1.5 Симбиотические бактерии, способствующие закреплению патогена в организме клеща 19
1.6 Симбиотические бактерии, препятствующие закреплению патогена в организме клеща 20
1.7 Реакции иммунной системы клещей на попадание в них патогенных возбудителей 20
1.9 Этапы, приводящие к успешной колонизации микроорганизмами кишечника
иксодовых клещей 23
1.10 Функциональная роль микробиома клещей 25
1.13 Методы изучения разнообразия микроорганизмов 28
2 Материалы и методы 32
2.1 Отлов клещей и изготовление фиксированных образцов 32
2.2 Выделение геномной ДНК из фиксированного материала клещей видов I. persulcatus и I. pavlovskyi фенол-хлороформным методом 33
2.3 Определение концентрации и качества ДНК с помощью спектрофотометра 35
2.6 Проведение ПЦР с праймерами на генетический материал Borrelia burgdorferi 35
2.4 Постановка электрофореза в агарозном геле 36
2.5 Подготовка библиотеки ДНК для секвенирования на MinlON (Oxford Nanopore
Technologies) 36
2.6 Очистка ДНК библиотеки для секвенирования на MinlON (Oxford Nanopore
Technologies) 37
2.7 Оценка концентрации ДНК-библиотеки после очистки с помощью флуориметра....38
2.8 Подготовка библиотеки для секвенирования и запуск секвенирования на MinION (Oxford Nanopore Technologies) 38
3 Результаты и обсуждение 40
3.1 Отлов иксодовых клещей, определение их видов и фиксация биологического материала 40
3.2 Выделение ДНК фенол-хлороформным методом из кишечников и тел без кишечников клещей 40
3.3 Анализ полученных образцов ДНК тел клещей без кишечников на генетический материал Borrelia spp 44
3.4 Подготовка ДНК-библиотек и секвенирование при помощи MinION (Oxford
Nanopore Technologies) 46
3.5 Биоинформатическая и статистическая обработка данных секвенирования 50
3.6 Оценка биоразнообразия микробиомов клещей видов I. persulcatus и I. pavlovskyi и их частей тела 54
ВЫВОДЫ 57
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ 58
Фундаментальной проблемой, на решение которой направлено данное исследование, является с огромной скоростью нарастающее распространение опасных заболеваний, переносимых иксодовыми клещами. Данная проблема актуальна не только в России, но и в других странах. Боррелиоз, эрлихиоз, туляремия, анаплазмоз и вирус клещевого энцефалита являются наиболее распространенными заболеваниями, которые переносят клещи. Патогены, переносимые клещами, могут вызывать болезни человека, имеющие пагубное воздействие на организм в целом. Угроза заболеть приводит людей к тому, что они в непродолжительный летний период избегают необрабатываемые территории и места отдыха, что ухудшает качество жизни. Также заболевания, переносимые иксодовыми клещами, наносят ущерб экономике Российской Федерации и других стран.
Помимо широкого спектра патогенных микроорганизмов, клещи переносят и непатогенные бактерии, в том числе на поверхности клеща и во многих органах: мальпигиевых сосудах, яичниках, кишечнике. Совокупность всех микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, принято называть микробиомом или микробиотой [Dietary fat intake and prevention ..., 2001].
Прикладной проблемой является слабая изученность состава микробиома иксодовых клещей, что не позволяет на данный момент в полной мере понять, как симбиотическая микробиота клеща влияет на его жизнедеятельность, а также как такие симбиотические микроорганизмы влияют на колонизацию клеща возбудителями опасных клещевых заболеваний. Также в ряд решаемых прикладных проблем входит нахождение способов эффективной индикации и устранения зараженных иксодовых клещей, которые являются переносчиками опасных для человека заболеваний, либо уничтожения самих патогенов внутри клеща. В будущем в определенные компоненты микробиома клещей можно будет внедрить генно-инженерные конструкции, которые будут способствовать решению фундаментальных и прикладных проблем.
Необходимо изучать патогенную и не патогенную микробиоту клещей в совокупности, находить закономерности взаимодействия и биохимические взаимосвязи как между микроорганизмами клещей, так и между клещами и микроорганизмами.
Для исследования были выбраны виды иксодовых клещей, такие как I. persulcatus и
I. pavlovskyi, так как они являются одними из наиболее распространённых видов иксодовых клещей в России и Томской области.
Объект исследования - клещи видов Ixodes persulcatus и Ixodes pavlovskyi. Микробиом клещей представляют собой предмет исследования. Стандартные микробиологические методы имеют ограниченное применение для изучения микробных сообществ внутри клеща, так как многие группы микроорганизмов не поддаются культивированию. Также при анализе микробиома клеща важно учесть как можно больше компонентов микробиома, которых может быть огромное количество. Поэтому для исследованиия применялся метод секвенирования нового поколения MinION (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания).
Определение видового состава микробиома проводилось по гену 16S рРНК, так как он содержит девять гипервариабельных участков и разделяющие их консервативные последовательности [16S ribosomal DNA amplification ..., 1991], по прочтениям которых можно определить таксономическую группу и вид живого организма. По количеству прочтений этого гена можно определить количественное соотношение составных частей микробиома.
Целью этого исследования является молекулярно-генетический анализ состава микробиома кишечников и тел без кишечников клещей видов Ixodes persulcatus P. Sch. 1930 и Ixodespavlovskyi Pom. 1946, собранных в окрестностях города Томска.
Задачи:
1. Сбор, определение видов и фиксация клещей видов I. persulcatus и I. pavlovskyi, собранных в окрестностях города Томска.
2. Выделение ДНК и подготовка ДНК-библиотек 16S рДНК из 4 групп образцов: кишечник I. persulcatus, кишечник I. pavlovskyi, тело без кишечника I. persulcatus, тело без кишечника I. pavlovskyi.
3. Секвенирование 16S рДНК на MinION (Oxford Nanopore Technologies), биоинформатическая и статистическая обработка данных секвенирования.
4. Анализ разнообразия микробиома у кишечников и тел без кишечников клещей видов I. persulcatus, и I. pavlovskyi.
Данная работа проводилась на кафедре генетики и клеточной биологии БИ ТГУ в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды. Адрес: г. Томск, пр. Ленина 36 к. 13.
Помимо широкого спектра патогенных микроорганизмов, клещи переносят и непатогенные бактерии, в том числе на поверхности клеща и во многих органах: мальпигиевых сосудах, яичниках, кишечнике. Совокупность всех микроорганизмов, обитающих в организме хозяина, принято называть микробиомом или микробиотой [Dietary fat intake and prevention ..., 2001].
Прикладной проблемой является слабая изученность состава микробиома иксодовых клещей, что не позволяет на данный момент в полной мере понять, как симбиотическая микробиота клеща влияет на его жизнедеятельность, а также как такие симбиотические микроорганизмы влияют на колонизацию клеща возбудителями опасных клещевых заболеваний. Также в ряд решаемых прикладных проблем входит нахождение способов эффективной индикации и устранения зараженных иксодовых клещей, которые являются переносчиками опасных для человека заболеваний, либо уничтожения самих патогенов внутри клеща. В будущем в определенные компоненты микробиома клещей можно будет внедрить генно-инженерные конструкции, которые будут способствовать решению фундаментальных и прикладных проблем.
Необходимо изучать патогенную и не патогенную микробиоту клещей в совокупности, находить закономерности взаимодействия и биохимические взаимосвязи как между микроорганизмами клещей, так и между клещами и микроорганизмами.
Для исследования были выбраны виды иксодовых клещей, такие как I. persulcatus и
I. pavlovskyi, так как они являются одними из наиболее распространённых видов иксодовых клещей в России и Томской области.
Объект исследования - клещи видов Ixodes persulcatus и Ixodes pavlovskyi. Микробиом клещей представляют собой предмет исследования. Стандартные микробиологические методы имеют ограниченное применение для изучения микробных сообществ внутри клеща, так как многие группы микроорганизмов не поддаются культивированию. Также при анализе микробиома клеща важно учесть как можно больше компонентов микробиома, которых может быть огромное количество. Поэтому для исследованиия применялся метод секвенирования нового поколения MinION (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания).
Определение видового состава микробиома проводилось по гену 16S рРНК, так как он содержит девять гипервариабельных участков и разделяющие их консервативные последовательности [16S ribosomal DNA amplification ..., 1991], по прочтениям которых можно определить таксономическую группу и вид живого организма. По количеству прочтений этого гена можно определить количественное соотношение составных частей микробиома.
Целью этого исследования является молекулярно-генетический анализ состава микробиома кишечников и тел без кишечников клещей видов Ixodes persulcatus P. Sch. 1930 и Ixodespavlovskyi Pom. 1946, собранных в окрестностях города Томска.
Задачи:
1. Сбор, определение видов и фиксация клещей видов I. persulcatus и I. pavlovskyi, собранных в окрестностях города Томска.
2. Выделение ДНК и подготовка ДНК-библиотек 16S рДНК из 4 групп образцов: кишечник I. persulcatus, кишечник I. pavlovskyi, тело без кишечника I. persulcatus, тело без кишечника I. pavlovskyi.
3. Секвенирование 16S рДНК на MinION (Oxford Nanopore Technologies), биоинформатическая и статистическая обработка данных секвенирования.
4. Анализ разнообразия микробиома у кишечников и тел без кишечников клещей видов I. persulcatus, и I. pavlovskyi.
Данная работа проводилась на кафедре генетики и клеточной биологии БИ ТГУ в лаборатории экологии, генетики и охраны окружающей среды. Адрес: г. Томск, пр. Ленина 36 к. 13.
1. Анализ микробиома кишечников и тел без кишечников иксодовых клещей, обитающих на территории г. Томска (I. persulcatus и I. pavlovskyi) выявил различия в разнообразии микроорганизмов как между видами, так и между органами.
2. Для микробиома кишечников I. persulcatus характерны представители родов Rickettsia, Haemophilus и Aeromonas. Микробиота тел без кишечников представлена родами Haemophilus и Aeromonas. У I. pavlovskyi в кишечном микробиоме преобладает род Francisella, в микробиоме тел без кишечников - Rickettsia. Бактерии родов Aeromonas и Haemophilus широко представлены только в телах без кишечников и кишечниках I. persulcatus. Для тел клещей без кишечников род Francisella не характерен, характерны представители рода Rickettsia.
3. Микробиомы I. pavlovskyi и I. persulcatus имеют значимые статистические различия (критерий Манна-Уитни, р = 0,0001, критерий альфа-разнообразия Shennon). Микробиота I. pavlovskyi более разнообразна, чем у I. persulcatus.
4. Микробиом кишечников иксодовых клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi имеет меньшее разнообразие по сравнению с микробиомом тел без кишечников клещей. Проведенный анализ показал значимые статистические различия (критерий Манна- Уитни, p = 0,0012, критерий альфа-разнообразия Shennon).
2. Для микробиома кишечников I. persulcatus характерны представители родов Rickettsia, Haemophilus и Aeromonas. Микробиота тел без кишечников представлена родами Haemophilus и Aeromonas. У I. pavlovskyi в кишечном микробиоме преобладает род Francisella, в микробиоме тел без кишечников - Rickettsia. Бактерии родов Aeromonas и Haemophilus широко представлены только в телах без кишечников и кишечниках I. persulcatus. Для тел клещей без кишечников род Francisella не характерен, характерны представители рода Rickettsia.
3. Микробиомы I. pavlovskyi и I. persulcatus имеют значимые статистические различия (критерий Манна-Уитни, р = 0,0001, критерий альфа-разнообразия Shennon). Микробиота I. pavlovskyi более разнообразна, чем у I. persulcatus.
4. Микробиом кишечников иксодовых клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi имеет меньшее разнообразие по сравнению с микробиомом тел без кишечников клещей. Проведенный анализ показал значимые статистические различия (критерий Манна- Уитни, p = 0,0012, критерий альфа-разнообразия Shennon).
