Помощь студентам в учебе
СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ТОНКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ПЛЕНОК
|
Введение 10
Цель и задачи исследования 12
Обзор литературы 14
1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии 14
1.1. Общие принципы работы сканирующего зондового микроскопа 15
1.2. Сканирующая туннельная микроскопия 17
1.3. Атомно-силовая микроскопия 18
1.3.1. Силовое взаимодействие зонда и образца 18
1.3.2. Принцип работы АСМ 22
1.4. Основные методы исследования биологических и органических объектов и структур 33
1.5. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот 38
1.5.1. Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот .... 39
1.5.2. Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов 46
Теоретическая часть 50
2. Анализ искажающих эффектов атомно-силовой микроскопии 50
2.1. Контактные деформации зонда и образца 50
2.1.1. Контакт двух тел: решение контактной задачи Герца 51
2.1.2. Контакт сферического зонда и сферического образца 54
2.1.3. Контакт сферического зонда и цилиндрического
образца 59
2.1.4. Динамика переходного процесса контактных де-формаций 71
2.1.5. Возможность достижения атомного разрешения с
помощью АСМ 72
2.2. Задача восстановления реальной геометрии объектов по АСМ-изображению (учет эффекта уширения) 85
2.2.1. Постановка и решение задачи об определении ширины объектов по измеренным параметрам АСМ- профиля 88
Экспериментальная часть 95
3. АСМ-исследования взаимодействия вирусной РНК с белками 95
3.1. Исследование процессов разрушения белковой оболочки
частиц вируса табачной мозаики и высвобождения вирусной РНК 95
3.1.1. Результаты и их обсуждение 100
3.1.2. Анализ распределения молекул РНК по длинам . . 109
3.1.3. Краткие выводы 118
4. Зондовая микроскопия процессов конденсации ДНК 120
4.1. Исследование конформационных изменений ДНК при взаимодействии с поверхностно-активными веществами . . 124
4.1.1. Возможность исследования конформационных свойств комплексов ДНК-ПАВ методом СТМ . . .127
4.1.2. Определение геометрии комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода/хлороформ, по результатам АСМ 129
4.2. Исследование изменений конформации ДНК в водно-спиртовых средах 138
4.2.1. Исследование сконденсированных в водно-спиртовой
среде молекул ДНК при проведении исследований на воздухе 139
4.2.2. Исследование процессов конденсации ДНК непосредственно в водно-спиртовой среде 141
4.2.3. Краткие выводы 151
5. Применение метода АСМ для анализа структуры тонких органических пленок 152
5.1. Влияние процессов внедрения CdTe-кластеров на структуру тонкопленочных покрытий бегеновой кислоты 157
5.1.1. Экспериментальная часть 158
5.1.2. Результаты и их обсуждение 159
5.2. Исследование тонких пленок белков 172
5.3. Исследование влияния условий формирования покрытий
и природы подложки на молекулярную упаковку тонких органических пленок 177
5.3.1. Результаты исследований молекулярной упаковки
тонких пленок 189
Заключение 202
Выводы 205
Благодарность 206
Библиография 206
A. Приложение 220
A.1. Программа, реализующая численное решение задачи о контактных деформациях зонда и цилиндрического образца220
A.2. Программа, реализующая численное решение задачи восстановления реальной геометрии объекта по измеренному АСМ-профилю 223
A.3. Параметры промышленных кантилеверов 226
Цель и задачи исследования 12
Обзор литературы 14
1. Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии 14
1.1. Общие принципы работы сканирующего зондового микроскопа 15
1.2. Сканирующая туннельная микроскопия 17
1.3. Атомно-силовая микроскопия 18
1.3.1. Силовое взаимодействие зонда и образца 18
1.3.2. Принцип работы АСМ 22
1.4. Основные методы исследования биологических и органических объектов и структур 33
1.5. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот 38
1.5.1. Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот .... 39
1.5.2. Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов 46
Теоретическая часть 50
2. Анализ искажающих эффектов атомно-силовой микроскопии 50
2.1. Контактные деформации зонда и образца 50
2.1.1. Контакт двух тел: решение контактной задачи Герца 51
2.1.2. Контакт сферического зонда и сферического образца 54
2.1.3. Контакт сферического зонда и цилиндрического
образца 59
2.1.4. Динамика переходного процесса контактных де-формаций 71
2.1.5. Возможность достижения атомного разрешения с
помощью АСМ 72
2.2. Задача восстановления реальной геометрии объектов по АСМ-изображению (учет эффекта уширения) 85
2.2.1. Постановка и решение задачи об определении ширины объектов по измеренным параметрам АСМ- профиля 88
Экспериментальная часть 95
3. АСМ-исследования взаимодействия вирусной РНК с белками 95
3.1. Исследование процессов разрушения белковой оболочки
частиц вируса табачной мозаики и высвобождения вирусной РНК 95
3.1.1. Результаты и их обсуждение 100
3.1.2. Анализ распределения молекул РНК по длинам . . 109
3.1.3. Краткие выводы 118
4. Зондовая микроскопия процессов конденсации ДНК 120
4.1. Исследование конформационных изменений ДНК при взаимодействии с поверхностно-активными веществами . . 124
4.1.1. Возможность исследования конформационных свойств комплексов ДНК-ПАВ методом СТМ . . .127
4.1.2. Определение геометрии комплексов ДНК-ПАВ, перешедших через границу раздела фаз вода/хлороформ, по результатам АСМ 129
4.2. Исследование изменений конформации ДНК в водно-спиртовых средах 138
4.2.1. Исследование сконденсированных в водно-спиртовой
среде молекул ДНК при проведении исследований на воздухе 139
4.2.2. Исследование процессов конденсации ДНК непосредственно в водно-спиртовой среде 141
4.2.3. Краткие выводы 151
5. Применение метода АСМ для анализа структуры тонких органических пленок 152
5.1. Влияние процессов внедрения CdTe-кластеров на структуру тонкопленочных покрытий бегеновой кислоты 157
5.1.1. Экспериментальная часть 158
5.1.2. Результаты и их обсуждение 159
5.2. Исследование тонких пленок белков 172
5.3. Исследование влияния условий формирования покрытий
и природы подложки на молекулярную упаковку тонких органических пленок 177
5.3.1. Результаты исследований молекулярной упаковки
тонких пленок 189
Заключение 202
Выводы 205
Благодарность 206
Библиография 206
A. Приложение 220
A.1. Программа, реализующая численное решение задачи о контактных деформациях зонда и цилиндрического образца220
A.2. Программа, реализующая численное решение задачи восстановления реальной геометрии объекта по измеренному АСМ-профилю 223
A.3. Параметры промышленных кантилеверов 226
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ), объединяющая широкий спектр современных методов исследования поверхности, насчитывает полтора десятка лет своей истории — с момента создания в 1981 г. Биннигом и Рорером сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [1, 2]. За прошедшие годы применение зондовой микроскопии позволило достичь уникальных научных результатов в различных областях физики, химии и биологии. Наиболее яркими демонстрациями возможностей этого экспериментального направления при исследовании поверхностей твердых тел могут служить: результаты по прямой визуализации реконструкции поверхностей [3ф манипуляция отдельными атомами для записи информации с рекордной плотностью, исследование локального влияния поверхностных дефектов на зонную структуру образца [4] и пр.
Новые экспериментальные возможности рассматриваемого направления в сравнении с традиционными методами исследования поверхности делают особенно перспективным применение зондовой микроскопии (в частности атомно-силовой микроскопии (АСМ) [5]) для изучения биологических и органических материалов. На этом пути в последние годы также был достигнут значительный прогресс. В частности, применительно к исследованиям нуклеиновых кислот, можно упомянуть о таких результатах, как визуализация отдельных молекул ДНК [6] и исследование их конформационного состояния в жидких средах, прямое измерение сил взаимодействия комплементарных нуклеотидов [7], визуализация в реальном масштабе времени процессов взаимодействия ДНК с белками [8].
В то же время зондовая микроскопия биологических и органических объектов и структур остается более сложной задачей в сравнении с СЗМ-анализом поверхностей твердых тел. Действительно, прошло более
9 например, поверхности Si(111)7 х 7 десяти лет с момента возникновения СЗМ, прежде чем была убедительно показана ее адекватность для исследований биообъектов (в 1992 г. на примере молекулы ДНК [6]). Это связано с такими особенностями подобных объектов, как низкая проводимость и невысокая механическая жесткость. Актуальной является проблема иммобилизации данных структур на поверхностях твердых подложек в процессах приготовления образцов и при исследованиях (особенно в жидких средах). Важно, чтобы объекты были зафиксированы на подложке в таком состоянии, чтобы было возможно исследовать их интересующие структурные особенности. Возможным подходом к решению этой задачи может служить, напри-мер, модификация свойств подложки путем контролируемого осаждения на ее поверхность тонких органических пленок с заданными свойствами.
Весьма важным для адекватного применения зондовых микроскопов в широкомасштабных научных исследованиях является отслеживание и систематизация возможных механизмов возникновения артефактов, т.е. аппаратных эффектов, приводящих к наблюдению ложных или искаженных свойств исследуемого объекта, которое может быть обусловлено, например, воздействием на объект самого инструмента исследования и пр.
Действительно, сканирующий зондовый микроскоп представляет собой «проектор», проецирующий объекты и явления микромира на доступный нашему восприятию «экран» — в силу многих причин удобно, чтобы им служил экран монитора компьютера. В этом случае проекция становиться отчасти «осязаемой», поскольку допускает возможность дополнительного анализа с помощью соответствующего программного обеспечения. Однако подобное «проецирование» несет только частичную информацию об объекте, к тому же отчасти искаженную влиянием самого «проектора». Восстановление по проекции реальных свойств исследуемых объектов является типичной обратной задачей, требующей решения и для зондовой микроскопии.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлась разработка методов исследования нуклеиновых кислот и их комплексов с помощью зондовой микроскопии.
В этой связи основными задачами настоящей работы являлись:
• разработка методов определения истинной геометрии объектов путем анализа экспериментально измеренных параметров их АСМ- изображений (учет артефактов);
• определение адекватных методик иммобилизации молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с белками и поверхностно-активными веществами в различных экспериментальных условиях (при проведении исследовании в жидких средах или на воздухе) на различных подложках;
• отработка подходов к решению задачи модификации свойств подложки путем контролируемого осаждения тонких органических пленок; исследование влияния на качество (однородность, бездефектность) и структуру сформированного покрытия специфики процедуры его формирования и природы подложки.
При решении основных задач возникла необходимость или возможность рассмотрения ряда дополнительных и вспомогательных вопросов и проблем. Так, анализируя проблему определения истинной геометрии объекта по результатам исследования АСМ (глава 2), рассмотрели два основных артефакта, проявляющихся при исследовании микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки: эффект уширения (раздел 2.2) и эффект занижения высот АСМ-профиля (раздел 2.1). При разработке методики количественного описания эффекта занижения высот привлекли теорию контактных деформаций; следствия ее применения для анализа результатов АСМ потребовали (этому посвящен раздел 2.1.5) объяснить с позиций контактной теории механизм АСМ-визуализации атомной или молекулярной структур поверхности.
Определение адекватной методики иммобилизации одноцепочечной вирусной РНК (глава 3) на поверхности подложки позволило визуализировать стадии процесса последовательного разрушения вирусной части-цы с высвобождением молекулы РНК, находящейся в белковой оболочке (раздел 3.1.1), и проанализировать неэквивалентность протекания этого процесса для двух концов вирусной частицы (раздел 3.1.2).
Разработка методов определения истинной геометрии объектов позволила, при проведении исследований компактизации } молекул ДНК (глава 4), проанализировать количественный молекулярный состав ком- пактизованных структур. Отработка методики исследования нуклеиновых кислот в жидких средах (описана в разделе 4.2.2) позволила изучить промежуточные стадии процесса компактизации ДНК непосредственно в жидкостной ячейке АСМ и определить структуру конденсированной молекулы.
При исследовании тонких пленок (см. главу 5), применение метода формирования искусственных дефектов (см. рис. 5.10) дало возможность проанализировать углы взаимоориентации осей решетки пленки и подложки. Кроме того, для ряда тонкопленочных покрытий удалось осуществить АСМ-визуализацию молекулярной упаковки и определить параметры элементарной ячейки. Это позволило сделать выводы о природе механизмов, определяющих молекулярную структуру пленок.
Новые экспериментальные возможности рассматриваемого направления в сравнении с традиционными методами исследования поверхности делают особенно перспективным применение зондовой микроскопии (в частности атомно-силовой микроскопии (АСМ) [5]) для изучения биологических и органических материалов. На этом пути в последние годы также был достигнут значительный прогресс. В частности, применительно к исследованиям нуклеиновых кислот, можно упомянуть о таких результатах, как визуализация отдельных молекул ДНК [6] и исследование их конформационного состояния в жидких средах, прямое измерение сил взаимодействия комплементарных нуклеотидов [7], визуализация в реальном масштабе времени процессов взаимодействия ДНК с белками [8].
В то же время зондовая микроскопия биологических и органических объектов и структур остается более сложной задачей в сравнении с СЗМ-анализом поверхностей твердых тел. Действительно, прошло более
9 например, поверхности Si(111)7 х 7 десяти лет с момента возникновения СЗМ, прежде чем была убедительно показана ее адекватность для исследований биообъектов (в 1992 г. на примере молекулы ДНК [6]). Это связано с такими особенностями подобных объектов, как низкая проводимость и невысокая механическая жесткость. Актуальной является проблема иммобилизации данных структур на поверхностях твердых подложек в процессах приготовления образцов и при исследованиях (особенно в жидких средах). Важно, чтобы объекты были зафиксированы на подложке в таком состоянии, чтобы было возможно исследовать их интересующие структурные особенности. Возможным подходом к решению этой задачи может служить, напри-мер, модификация свойств подложки путем контролируемого осаждения на ее поверхность тонких органических пленок с заданными свойствами.
Весьма важным для адекватного применения зондовых микроскопов в широкомасштабных научных исследованиях является отслеживание и систематизация возможных механизмов возникновения артефактов, т.е. аппаратных эффектов, приводящих к наблюдению ложных или искаженных свойств исследуемого объекта, которое может быть обусловлено, например, воздействием на объект самого инструмента исследования и пр.
Действительно, сканирующий зондовый микроскоп представляет собой «проектор», проецирующий объекты и явления микромира на доступный нашему восприятию «экран» — в силу многих причин удобно, чтобы им служил экран монитора компьютера. В этом случае проекция становиться отчасти «осязаемой», поскольку допускает возможность дополнительного анализа с помощью соответствующего программного обеспечения. Однако подобное «проецирование» несет только частичную информацию об объекте, к тому же отчасти искаженную влиянием самого «проектора». Восстановление по проекции реальных свойств исследуемых объектов является типичной обратной задачей, требующей решения и для зондовой микроскопии.
Цель и задачи исследования
Целью работы являлась разработка методов исследования нуклеиновых кислот и их комплексов с помощью зондовой микроскопии.
В этой связи основными задачами настоящей работы являлись:
• разработка методов определения истинной геометрии объектов путем анализа экспериментально измеренных параметров их АСМ- изображений (учет артефактов);
• определение адекватных методик иммобилизации молекул нуклеиновых кислот и их комплексов с белками и поверхностно-активными веществами в различных экспериментальных условиях (при проведении исследовании в жидких средах или на воздухе) на различных подложках;
• отработка подходов к решению задачи модификации свойств подложки путем контролируемого осаждения тонких органических пленок; исследование влияния на качество (однородность, бездефектность) и структуру сформированного покрытия специфики процедуры его формирования и природы подложки.
При решении основных задач возникла необходимость или возможность рассмотрения ряда дополнительных и вспомогательных вопросов и проблем. Так, анализируя проблему определения истинной геометрии объекта по результатам исследования АСМ (глава 2), рассмотрели два основных артефакта, проявляющихся при исследовании микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки: эффект уширения (раздел 2.2) и эффект занижения высот АСМ-профиля (раздел 2.1). При разработке методики количественного описания эффекта занижения высот привлекли теорию контактных деформаций; следствия ее применения для анализа результатов АСМ потребовали (этому посвящен раздел 2.1.5) объяснить с позиций контактной теории механизм АСМ-визуализации атомной или молекулярной структур поверхности.
Определение адекватной методики иммобилизации одноцепочечной вирусной РНК (глава 3) на поверхности подложки позволило визуализировать стадии процесса последовательного разрушения вирусной части-цы с высвобождением молекулы РНК, находящейся в белковой оболочке (раздел 3.1.1), и проанализировать неэквивалентность протекания этого процесса для двух концов вирусной частицы (раздел 3.1.2).
Разработка методов определения истинной геометрии объектов позволила, при проведении исследований компактизации } молекул ДНК (глава 4), проанализировать количественный молекулярный состав ком- пактизованных структур. Отработка методики исследования нуклеиновых кислот в жидких средах (описана в разделе 4.2.2) позволила изучить промежуточные стадии процесса компактизации ДНК непосредственно в жидкостной ячейке АСМ и определить структуру конденсированной молекулы.
При исследовании тонких пленок (см. главу 5), применение метода формирования искусственных дефектов (см. рис. 5.10) дало возможность проанализировать углы взаимоориентации осей решетки пленки и подложки. Кроме того, для ряда тонкопленочных покрытий удалось осуществить АСМ-визуализацию молекулярной упаковки и определить параметры элементарной ячейки. Это позволило сделать выводы о природе механизмов, определяющих молекулярную структуру пленок.
Целью проведенных исследований служила разработка зондово-микроскопических методов исследования нуклеиновых кислот. Попутно, при решении задач контролируемой модификации свойств подложки для иммобилизации нуклеиновых кислот, были затронуты вопросы, связанные с тонкими органическими пленками: выяснение основных механизмов, определяющих структуру покрытия.
Исследования органических пленок, сформированных по технологии ЛБ, показали, что они являются весьма перспективным объектом для СЗМ-анализа, поскольку методы зондовой микроскопии могут позволить получить здесь принципиально новую информацию. Поэтому мы провели ряд исследований тонкопленочных покрытий (глава 5) в которых эти структуры являлись основным объектом исследования (безотносительно к нуклеиновым кислотам). В экспериментах мы анализировали влияние процедуры выделения пленки, состава субфазы и природы подложки как на микроструктуру пленки (дефектность и однородность на микронных размерах поверхности), так и на молекулярную упаковку молекул в сформированных покрытиях.
Возможность достижения молекулярного разрешения при исследовании плоских поверхностей (тонких пленок, кристаллических подложек), и невозможность достижения столь же высокого латерального пространственного разрешения в исследованиях нуклеиновых кислот и вирусных частиц, требовали объяснения. Вопрос о механизме достижения «атомного» разрешения в АСМ возник и в свете результатов применения теории контактных деформаций для описания контакта зонда и образца (раздел 2.1 — учет эффекта занижения высот АСМ-изображений объектов). Действительно, согласно соотношениям Герца этой теории, размер области контакта зонда и образца при типичных условиях АСМ- исследований на воздухе составляет единицы квадратных нанометров и значительно превышает, например, типичную площадь на молекулу в ЛБ пленках ~ 0,2 нм2. В разделе2.1.5 механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности был обоснован с позиций контактной теории, что позволило объяснить ряд экспериментально наблюдаемых закономерностей.
С использованием соотношений Герца удалось разработать методику определения упругих параметров отдельных микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Эта методика нашла отражение в экспериментальной части задачи * «Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот» специального физического практикума по зондовой микроскопии кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ. Измерения по результатам АСМ- эксперимента, проводимые студентами, подтвердили, в частности, что деформации микрообъектов с характерными размерами ~ 10 нм (и более) хорошо описываются теорией контактных деформаций.
Перспективы применения разработанных подходов
Алгоритм построения численного решения для учета эффекта уширения, разработанный в разделе 2.2, представляется весьма простым в реализации, а проведение расчетов фактически не требует каких-либо затрат компьютерного времени. Это позволяет надеяться, что предложенная методика найдет применение среди специалистов, занимающихся зондовой микроскопией биоструктур. Среди отличительных особенностей реализованного подхода стоит упомянуть его общность («эллипсоидальный» объект *), а также наличие «реперных» соотношений (2.38) и (2.39), позволяющих оценить «остроту» самого зонда непосредственно по анализируемому АСМ-изображению.
Логическим обобщением результатов четвертой и пятой глав стали проводимые нами в последнее время исследования влияния молекул ДНК и синтетических полиэлектролитов, присутствующих в субфазе, на свойства ленгмюровских пленок поверхностно-активных веществ, находящихся на поверхности жидкой субфазы (и переносимых для АСМ-исследований на твердую подложку). Полученные результаты носят предварительный характер (и не вошли в диссертацию), однако позволяют сделать вывод о высокой чувствительности структуры и свойств сформированных монослоев к природе объектов, находящихся в субфазе. Различие во влиянии, оказываемом молекулами ДНК и синтетическими полиэлектролитами (полиметакриловой кислоты) на структуру монослоев позволяет констатировать различие механизмов их взаимо-действия с ПАВ.
Результаты проводимых нами исследований тонких пленок свидетельствуют о большом потенциале метода АСМ в этой области (это частично отражено в диссертации). Действительно, позволяя непосредственно «видеть» структуру поверхности и измерять ее характерные параметры, метод АСМ служит удачным дополнением других физических методов исследования тонких пленок. Это позволяет адекватно интерпретировать результаты комплексных исследований. Представляется, что набор достаточного количества фактических экспериментальных данных позволит, при их анализе и обобщении, сделать фундаментальные выводы относительно основных механизмов, определяющих структуру тонкопленочных покрытий. Есть все основания полагать, что метод зондовой микроскопии найдет в ближайшее годы широкое применение в этой области исследований и результаты, изложенные в работе, будут полезны при обобщающем анализе.
Определение адекватной методики иммобилизации одноцепочечной вирусной РНК (глава 3) на поверхности подложки позволяет нам в настоящее время проводить исследования биоспецифического взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Разработанные подходы могут быть полезны в актуальных микробиологических исследованиях, проводимых в условиях, максимально близких нативным.
В заключении сформулируем основные выводы по результатам, изложенным в диссертационной работе. Эти положения выносятся на за-щиту.
Исследования органических пленок, сформированных по технологии ЛБ, показали, что они являются весьма перспективным объектом для СЗМ-анализа, поскольку методы зондовой микроскопии могут позволить получить здесь принципиально новую информацию. Поэтому мы провели ряд исследований тонкопленочных покрытий (глава 5) в которых эти структуры являлись основным объектом исследования (безотносительно к нуклеиновым кислотам). В экспериментах мы анализировали влияние процедуры выделения пленки, состава субфазы и природы подложки как на микроструктуру пленки (дефектность и однородность на микронных размерах поверхности), так и на молекулярную упаковку молекул в сформированных покрытиях.
Возможность достижения молекулярного разрешения при исследовании плоских поверхностей (тонких пленок, кристаллических подложек), и невозможность достижения столь же высокого латерального пространственного разрешения в исследованиях нуклеиновых кислот и вирусных частиц, требовали объяснения. Вопрос о механизме достижения «атомного» разрешения в АСМ возник и в свете результатов применения теории контактных деформаций для описания контакта зонда и образца (раздел 2.1 — учет эффекта занижения высот АСМ-изображений объектов). Действительно, согласно соотношениям Герца этой теории, размер области контакта зонда и образца при типичных условиях АСМ- исследований на воздухе составляет единицы квадратных нанометров и значительно превышает, например, типичную площадь на молекулу в ЛБ пленках ~ 0,2 нм2. В разделе2.1.5 механизм АСМ-визуализации атомной структуры поверхности был обоснован с позиций контактной теории, что позволило объяснить ряд экспериментально наблюдаемых закономерностей.
С использованием соотношений Герца удалось разработать методику определения упругих параметров отдельных микрообъектов, адсорбированных на поверхность твердой подложки. Эта методика нашла отражение в экспериментальной части задачи * «Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот» специального физического практикума по зондовой микроскопии кафедры физики полимеров и кристаллов физического факультета МГУ. Измерения по результатам АСМ- эксперимента, проводимые студентами, подтвердили, в частности, что деформации микрообъектов с характерными размерами ~ 10 нм (и более) хорошо описываются теорией контактных деформаций.
Перспективы применения разработанных подходов
Алгоритм построения численного решения для учета эффекта уширения, разработанный в разделе 2.2, представляется весьма простым в реализации, а проведение расчетов фактически не требует каких-либо затрат компьютерного времени. Это позволяет надеяться, что предложенная методика найдет применение среди специалистов, занимающихся зондовой микроскопией биоструктур. Среди отличительных особенностей реализованного подхода стоит упомянуть его общность («эллипсоидальный» объект *), а также наличие «реперных» соотношений (2.38) и (2.39), позволяющих оценить «остроту» самого зонда непосредственно по анализируемому АСМ-изображению.
Логическим обобщением результатов четвертой и пятой глав стали проводимые нами в последнее время исследования влияния молекул ДНК и синтетических полиэлектролитов, присутствующих в субфазе, на свойства ленгмюровских пленок поверхностно-активных веществ, находящихся на поверхности жидкой субфазы (и переносимых для АСМ-исследований на твердую подложку). Полученные результаты носят предварительный характер (и не вошли в диссертацию), однако позволяют сделать вывод о высокой чувствительности структуры и свойств сформированных монослоев к природе объектов, находящихся в субфазе. Различие во влиянии, оказываемом молекулами ДНК и синтетическими полиэлектролитами (полиметакриловой кислоты) на структуру монослоев позволяет констатировать различие механизмов их взаимо-действия с ПАВ.
Результаты проводимых нами исследований тонких пленок свидетельствуют о большом потенциале метода АСМ в этой области (это частично отражено в диссертации). Действительно, позволяя непосредственно «видеть» структуру поверхности и измерять ее характерные параметры, метод АСМ служит удачным дополнением других физических методов исследования тонких пленок. Это позволяет адекватно интерпретировать результаты комплексных исследований. Представляется, что набор достаточного количества фактических экспериментальных данных позволит, при их анализе и обобщении, сделать фундаментальные выводы относительно основных механизмов, определяющих структуру тонкопленочных покрытий. Есть все основания полагать, что метод зондовой микроскопии найдет в ближайшее годы широкое применение в этой области исследований и результаты, изложенные в работе, будут полезны при обобщающем анализе.
Определение адекватной методики иммобилизации одноцепочечной вирусной РНК (глава 3) на поверхности подложки позволяет нам в настоящее время проводить исследования биоспецифического взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Разработанные подходы могут быть полезны в актуальных микробиологических исследованиях, проводимых в условиях, максимально близких нативным.
В заключении сформулируем основные выводы по результатам, изложенным в диссертационной работе. Эти положения выносятся на за-щиту.