ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ПОД ВЛИЯНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ
|
Введение 4
1. Обзор литературы по теме исследования 4
1.1. Клеточная терапия в регенеративной медицине 7
1.2. Способы регенерации нервной ткани 12
1.3. Биофармацевтические препараты 16
1.4. Клеточные культуры как модель для исследования in vitro 19
1.5. Активность биофармацевтических препаратов 22
2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Реактивы и расходные материалы 24
2.2. Методика получения первичной культуры дермальных фибробластов
крысы 25
2.2.1. Выделение первичной культуры дермальных фибробластов крысы .... 25
2.2.2. Пассирование первичной культуры дермальных фибробластов крысы 26
2.2.3. Криоконсервация первичной культуры дермальных фибробластов
крысы 26
2.2.4. Деконсервация первичной культуры дермальных фибробластов крысы
27
2.3. Методика получения первичной культуры клеток головного мозга крысы
27
2.3.1. Выделение клеток головного мозга крысы 27
2.3.2. Культивирование и пассирование первичной культуры клеток головного
мозга крысы 28
2.3.3. Криоконсервация первичной культуры клеток головного мозга крысы
28
2.3.4. Деконсервация первичной культуры клеток головного мозга крысы ... 29
2.4. Иммуноцитохимическое исследование клеток головного мозга крысы . . 29
2.5. Оценка активности исследуемых препаратов с помощью теста «Модель
раны» 30
2.6. Статистический анализ 33
3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 34
3.1. Получение и культивирование дермальных фибробластов крысы 34
3.2. Выделение и культивирование клеток головного мозга крысы 35
3.3. Изучение активности первичных культур дермальных фибробластов и клеток головного мозга крысы под влиянием регенеративных препаратов ... 40
3.3.1. Особенности перемещения первичных культур дермальных
фибробластов и клеток головного мозга крысы 40
3.3.2. Регенеративная активность дермальных фибробластов крысы под
влиянием биологических препаратов 42
3.3.3. Влияние биофармацевтических препаратов на миграционную и
пролиферативную активности клеток головного мозга крысы 47
Заключение 54
Список использованной литературы: 56
1. Обзор литературы по теме исследования 4
1.1. Клеточная терапия в регенеративной медицине 7
1.2. Способы регенерации нервной ткани 12
1.3. Биофармацевтические препараты 16
1.4. Клеточные культуры как модель для исследования in vitro 19
1.5. Активность биофармацевтических препаратов 22
2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Реактивы и расходные материалы 24
2.2. Методика получения первичной культуры дермальных фибробластов
крысы 25
2.2.1. Выделение первичной культуры дермальных фибробластов крысы .... 25
2.2.2. Пассирование первичной культуры дермальных фибробластов крысы 26
2.2.3. Криоконсервация первичной культуры дермальных фибробластов
крысы 26
2.2.4. Деконсервация первичной культуры дермальных фибробластов крысы
27
2.3. Методика получения первичной культуры клеток головного мозга крысы
27
2.3.1. Выделение клеток головного мозга крысы 27
2.3.2. Культивирование и пассирование первичной культуры клеток головного
мозга крысы 28
2.3.3. Криоконсервация первичной культуры клеток головного мозга крысы
28
2.3.4. Деконсервация первичной культуры клеток головного мозга крысы ... 29
2.4. Иммуноцитохимическое исследование клеток головного мозга крысы . . 29
2.5. Оценка активности исследуемых препаратов с помощью теста «Модель
раны» 30
2.6. Статистический анализ 33
3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 34
3.1. Получение и культивирование дермальных фибробластов крысы 34
3.2. Выделение и культивирование клеток головного мозга крысы 35
3.3. Изучение активности первичных культур дермальных фибробластов и клеток головного мозга крысы под влиянием регенеративных препаратов ... 40
3.3.1. Особенности перемещения первичных культур дермальных
фибробластов и клеток головного мозга крысы 40
3.3.2. Регенеративная активность дермальных фибробластов крысы под
влиянием биологических препаратов 42
3.3.3. Влияние биофармацевтических препаратов на миграционную и
пролиферативную активности клеток головного мозга крысы 47
Заключение 54
Список использованной литературы: 56
Изучение механизмов регенерации и создание на их основе медицинских технологий позволит излечивать тяжелейшие заболевания, которые ранее считались неизлечимыми или требовали длительной терапии. Такой эффект возможно получить благодаря методам регенеративной медицины.
Стремительное развитие регенеративной медицины привело к формированию ее нового направления - клеточной терапии. Помимо трансплантации уже готовых стволовых клеток в патологический участок, клеточная терапия изучает способы мобилизации эндогенных ресурсов организма - региональных стволовых клеток - в дегенеративный участок. Такими регуляторами могут выступать различные биологически активные вещества (цитокины, регуляторные пептиды, хемокины и др.) [13].
Как известно, приобретенные или генетические нейродегенеративные заболевания зачастую носят необратимый характер, так как нервная ткань у млекопитающих и человека имеет низкую регенеративную способность. Однако в нервной ткани присутствуют региональные мультипотентные стволовые клетки, которые способны к замещению дефектов и частично восстанавливают структуру нервной ткани и ее функции. Активацию региональных стволовых клеток запускают различные факторы, в том числе и метаболиты самих стволовых клеток. Есть вероятность, что введение таких факторов в организм в качестве биофармацевтических средств позволит регулировать процессы восстановления в нервных тканях.
Компания «НовиСтем» выпускает биофармацевтические ветеринарные препараты линейки ULTRACELL- для кошек, собак и лошадей, не имеющие аналогов в мире. Данная группа лекарственных средств оказывает регенерирующее действие на организм благодаря белково-пептидному комплексу, полученному из кондиционной среды при культивировании МСК животных. Полученные ранее данные о возможном регенерирующем влиянии ULTRACELL-DOG на нервную ткань, способствовали началу исследований действия препарата на восстановление нервной ткани.
Биофармацевтические терапевтические препараты проходят контроль качества, подтверждающий их безопасность, подлинность, физико-химические, микробиологические и другие показатели. Но одним из наиболее важных показателей качества является эффективность - «характеристика степени положительного влияния лекарственного препарата на течение, продолжительность заболевания или его предотвращение...» [40, с. 4].
В нашем эксперименте в качестве показателя эффективности выступает «регенеративная активность препарата» - количественная мера эффективного действия лекарственного средства, проявляющаяся в совокупности морфологических и некоторых физиологических параметров, таких как миграционная и пролиферативная активность клеточных культур, выраженная в процентном отношении к отрицательному контролю.
Объект исследования - культуры клеток головного мозга крысы и дермальные фибробласты крысы
Предмет исследования - морфологические параметры, миграционная и пролиферативная активности клеточных культур под влиянием биофармацевтических препаратов
Цель работы - изучение действия препарата ULTRACELL-DOG на морфологические характеристики и функциональные свойства первичных культур клеток головного мозга крысы (КГМк) и дермальных фибробластов крысы (ДФк) в сравнении с референсным препаратом.
Задачи исследования:
1. Освоить методики получения первичных КГМк и ДФк.
2. Исследовать морфофункциональные особенности полученных клеточных культур.
3. Изучить активности КГМк и ДФк в условиях действия биологических терапевтических средств.
4. Сравнить регенеративные активности исследуемых препаратов.
Впервые введен термин «регенеративная активность» и проведена оценка регенеративной активности биофармацевтического ветеринарного препаратов «ULTRACELL-DOG» и «Кортексин» на первичных культурах клеток головного мозга крысы и дермальных фибробластах крысы. Впервые использовалась первичная культура клеток головного мозга крысы для оценки пролиферативной и миграционной активности биофармацевтических средств.
Практическая значимость исследования состоит в том, что модель пролиферативной и миграционной активности первичной культуры клеток головного мозга крысы в фармацевтических предприятиях позволит оценивать эффективность биологических препаратов для лечения различных заболеваний, в том числе и патологий нервной системы.
Работа содержит 67 страниц и 97 источников литературы. В магистерской диссертации используются 23 рисунков, 6 таблиц и 4 математических формулы. Приложения в работе отсутствуют.
Стремительное развитие регенеративной медицины привело к формированию ее нового направления - клеточной терапии. Помимо трансплантации уже готовых стволовых клеток в патологический участок, клеточная терапия изучает способы мобилизации эндогенных ресурсов организма - региональных стволовых клеток - в дегенеративный участок. Такими регуляторами могут выступать различные биологически активные вещества (цитокины, регуляторные пептиды, хемокины и др.) [13].
Как известно, приобретенные или генетические нейродегенеративные заболевания зачастую носят необратимый характер, так как нервная ткань у млекопитающих и человека имеет низкую регенеративную способность. Однако в нервной ткани присутствуют региональные мультипотентные стволовые клетки, которые способны к замещению дефектов и частично восстанавливают структуру нервной ткани и ее функции. Активацию региональных стволовых клеток запускают различные факторы, в том числе и метаболиты самих стволовых клеток. Есть вероятность, что введение таких факторов в организм в качестве биофармацевтических средств позволит регулировать процессы восстановления в нервных тканях.
Компания «НовиСтем» выпускает биофармацевтические ветеринарные препараты линейки ULTRACELL- для кошек, собак и лошадей, не имеющие аналогов в мире. Данная группа лекарственных средств оказывает регенерирующее действие на организм благодаря белково-пептидному комплексу, полученному из кондиционной среды при культивировании МСК животных. Полученные ранее данные о возможном регенерирующем влиянии ULTRACELL-DOG на нервную ткань, способствовали началу исследований действия препарата на восстановление нервной ткани.
Биофармацевтические терапевтические препараты проходят контроль качества, подтверждающий их безопасность, подлинность, физико-химические, микробиологические и другие показатели. Но одним из наиболее важных показателей качества является эффективность - «характеристика степени положительного влияния лекарственного препарата на течение, продолжительность заболевания или его предотвращение...» [40, с. 4].
В нашем эксперименте в качестве показателя эффективности выступает «регенеративная активность препарата» - количественная мера эффективного действия лекарственного средства, проявляющаяся в совокупности морфологических и некоторых физиологических параметров, таких как миграционная и пролиферативная активность клеточных культур, выраженная в процентном отношении к отрицательному контролю.
Объект исследования - культуры клеток головного мозга крысы и дермальные фибробласты крысы
Предмет исследования - морфологические параметры, миграционная и пролиферативная активности клеточных культур под влиянием биофармацевтических препаратов
Цель работы - изучение действия препарата ULTRACELL-DOG на морфологические характеристики и функциональные свойства первичных культур клеток головного мозга крысы (КГМк) и дермальных фибробластов крысы (ДФк) в сравнении с референсным препаратом.
Задачи исследования:
1. Освоить методики получения первичных КГМк и ДФк.
2. Исследовать морфофункциональные особенности полученных клеточных культур.
3. Изучить активности КГМк и ДФк в условиях действия биологических терапевтических средств.
4. Сравнить регенеративные активности исследуемых препаратов.
Впервые введен термин «регенеративная активность» и проведена оценка регенеративной активности биофармацевтического ветеринарного препаратов «ULTRACELL-DOG» и «Кортексин» на первичных культурах клеток головного мозга крысы и дермальных фибробластах крысы. Впервые использовалась первичная культура клеток головного мозга крысы для оценки пролиферативной и миграционной активности биофармацевтических средств.
Практическая значимость исследования состоит в том, что модель пролиферативной и миграционной активности первичной культуры клеток головного мозга крысы в фармацевтических предприятиях позволит оценивать эффективность биологических препаратов для лечения различных заболеваний, в том числе и патологий нервной системы.
Работа содержит 67 страниц и 97 источников литературы. В магистерской диссертации используются 23 рисунков, 6 таблиц и 4 математических формулы. Приложения в работе отсутствуют.
1. Отработана методика получения культуры ДФк по ранее разработанным методикам других авторов.
Для получения клеток головного мозга крысы была проведена серия экспериментов, в результате которых был отработан способ выделения клеток, при котором самая высокая жизнеспособность при наиболее высоком выходе клеток достигалась при инкубации ткани головного мозга крысы в 0,1% раствором трипсина в течение 10 мин.
2. Культура ДФК имеет типичную веретенообразную форму практически на всем протяжении ее культивирования. Культура клеток головного мозга крысы имеет гетерогенную структуру. В ней встречаются клетки нескольких типов: веретенообразные, нейроподобные и глиеподобные.
Морфология клеток, инкубируемых в среде с препаратами, была аналогичной клеткам, культивируемым в положительном и отрицательном контролях. Отсутствовали цитоплазматические грануляция и васкуляризация, клетки содержали одно ядро.
3. Заполнение царапины в культурах происходит по-разному. Мелкие клетки культуры клеток головного мозга крысы перемещаются в царапину, увеличиваются в размерах и примыкают к монослою. Движение клеток дермальных фибробластов крысы сопровождается дезинтеграцией клеточного монослоя по краям «раны» и миграцией клеток в свободное пространство.
Применение препаратов UltraCell-Dog и Кортексина во всех разведения оказывало стимулирующий эффект на степень зарастания царапины в первичных культурах клеток головного мозга и дермальных фибробластов крысы.
4. Регенеративная активность препарата UltraCell-Dog показала наибольший эффект на культуре ДФК, при том, что концентрация препарата не влияла на проявление стимулирующего эффекта ДФК. Стимулирующее действие UltraCell-Dog на КГМ крысы, а также Кортексина на КГМ крысы и
55 ДФК на зарастание просвета «раны» имеет одинаковую тенденцию: регенеративная активность тем выше, чем меньше разведение препарата. Кроме того, наименьшую эффективность проявляют препарат UltraCell-Dog на клетки головного мозга крысы, а также Кортексина на КГМ крысы и дермальные фибробласты крысы при разведении 1:10000.
Для получения клеток головного мозга крысы была проведена серия экспериментов, в результате которых был отработан способ выделения клеток, при котором самая высокая жизнеспособность при наиболее высоком выходе клеток достигалась при инкубации ткани головного мозга крысы в 0,1% раствором трипсина в течение 10 мин.
2. Культура ДФК имеет типичную веретенообразную форму практически на всем протяжении ее культивирования. Культура клеток головного мозга крысы имеет гетерогенную структуру. В ней встречаются клетки нескольких типов: веретенообразные, нейроподобные и глиеподобные.
Морфология клеток, инкубируемых в среде с препаратами, была аналогичной клеткам, культивируемым в положительном и отрицательном контролях. Отсутствовали цитоплазматические грануляция и васкуляризация, клетки содержали одно ядро.
3. Заполнение царапины в культурах происходит по-разному. Мелкие клетки культуры клеток головного мозга крысы перемещаются в царапину, увеличиваются в размерах и примыкают к монослою. Движение клеток дермальных фибробластов крысы сопровождается дезинтеграцией клеточного монослоя по краям «раны» и миграцией клеток в свободное пространство.
Применение препаратов UltraCell-Dog и Кортексина во всех разведения оказывало стимулирующий эффект на степень зарастания царапины в первичных культурах клеток головного мозга и дермальных фибробластов крысы.
4. Регенеративная активность препарата UltraCell-Dog показала наибольший эффект на культуре ДФК, при том, что концентрация препарата не влияла на проявление стимулирующего эффекта ДФК. Стимулирующее действие UltraCell-Dog на КГМ крысы, а также Кортексина на КГМ крысы и
55 ДФК на зарастание просвета «раны» имеет одинаковую тенденцию: регенеративная активность тем выше, чем меньше разведение препарата. Кроме того, наименьшую эффективность проявляют препарат UltraCell-Dog на клетки головного мозга крысы, а также Кортексина на КГМ крысы и дермальные фибробласты крысы при разведении 1:10000.
