Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Изучение возможностей золотых пористых встречно-штыревых электродов в качестве сенсорной платформы для определения олигонуклеотидов

Работа №171358

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

химия

Объем работы122
Год сдачи2023
Стоимость4900 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
1
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


Перечень условных обозначений 4
Введение 5
1. Обзор литературы 7
1.1. Описание олигонуклеотидов в качестве аналитов 7
1.2. Описание биологических жидкостей в качестве объектов анализа 16
1.3. Методы, используемые для количественного определения
олигонуклеотидов 19
1.4. Электроды, используемые в электрохимических методах анализа для
определения ДНК, РНК и олигонуклеотидов 26
1.5. Описание встречно-штыревых электродов (ВШЭ) 28
1.6. Применение пористого золота в качестве электродного материала в
электроанализе 31
1.7. Постановка целей и задач исследования 34
2. Используемые методы 36
2.1. Сканирующая электронная микроскопия и энергодисперсионный
рентгеновский анализ 36
2.2. Циклическая вольтамперометрия 37
2.3. Спектроскопия электрохимического импеданса 40
3. Экспериментальная часть 48
3.1. Перечень используемых химических реактивов 48
3.2. Методики приготовления растворов 48
3.3. Перечень используемых приборов и оборудования 49
3.4. Устройство электрохимических ячеек 50
3.5. Этапы проведения электрохимического эксперимента 52
4. Результаты и их обсуждение 54
4.1. Характеризация используемых золотых пористых ВШЭ 54
4.2 Очистка поверхности золотых пористых ВШЭ 61
4.3. Иммобилизация олигонуклеотида-ловушки на поверхности ВШЭ 68
4.4. Модификация поверхности ВШЭ, самоорганизующимся монослоем 80
4.5. Гибридизация молекул олигонуклеотида-аналита с молекулами
олигонуклеотида-ловушки на поверхности ВШЭ 87
4.6. Сравнение аналитических сигналов от сенсоров на основе пористого и
гладкого ВШЭ 98
Заключение и выводы 104
Благодарности 105
Список литературы 106


Олигонуклеотиды - это короткие последовательности нуклеотидов, которые имеют множество важных биологических функций. Они играют значимую роль в генетике, иммунологии, диагностике и терапии заболеваний. В медицине количественное определение олигонуклеотидов является критически важным для диагностики и лечения многих заболеваний.
На данный момент в медицинской практике наиболее часто применяется полимерная цепная реакция (ПЦР) (англ. PCR) как основной метод определения олигонуклеотидов. Со времени создания и по сегодняшний день, меньше, чем за 50 лет, ПЦР-анализ уже внёс ощутимый вклад в массовую диагностику инфекционных, вирусных и бактериальных заболеваний, благодаря относительной быстроте и высокой специфичности [1-6]. Большинство методов ПЦР основаны на термическом циклировании, вследствие которого происходит увеличение целевых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) до размеров от 100 до 10000 пар оснований. По количеству амплифицированного продукта и происходит дальнейшее изучение или анализ целевого фрагмента олигонуклеотида. Основные варианты исполнения анализа методом ПЦР являются качественными методами анализа содержания олигонуклеотидов в биологической матрице [7]. Исключением можно считать вариант исполнения количественного ПЦР (qPCR), который, в свою очередь, так же имеет большое число модификаций. Такой метод позволяет не только детектировать наличие целевой последовательности олигонуклеотидов в образце, но и измерять их количество. Кроме того, ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) отслеживает увеличение целевого фрагмента ДНК во время полимерной цепной реакции и может использоваться для полуколичественной и количественной оценки содержания целевого фрагмента олигонуклеотида. Для проведения количественного определения олигонуклеотидов методом ПЦР используются неспецифичные по отношению к целевой молекуле интеркалирующие красители и специфичные ДНК-зонды, вызывающие флуоресценцию [8-11]. Вследствие использования более
дорогостоящего оборудования и реагентов для количественного определения олигонуклеотидов, стоимость анализа повышается.
Использование электрохимических методов анализа для количественного определения олигонуклеотидов является перспективным направлением развития диагностики заболеваний вследствие дешевизны приборного исполнения анализа и достаточной быстроты его выполнения. Поэтому разработка миниатюрных электрохимических сенсоров для количественного определения олигонуклеотидов является актуальной в сегодняшнее время задачей. Примером таких сенсоров являются сенсоры, основанные на комплементарном связывании олигонуклеотида-ловушки с целевым олигонуклеотидом-аналитом. Одним из способов повышения чувствительности электрохимического детектирования олигонуклеотидов является использование в качестве сенсорной платформы встречно-штыревых электродов. Ранее было описано использование встречно-штыревых электродов из гладкого золота для количественно определения олигонуклеотидов - биомаркеров заболеваний. Дальнейшее улучшение аналитических характеристик подобных сенсоров может быть достигнуто с увеличением удельной поверхности электрода, за счёт использования пористых материалов. Увеличение удельной поверхности ВШЭ в данной работе было достигнуто за счёт использования электродов из пористого золота, ранее подобные структуры с изучены не были.
Цель настоящей работы состоит в изучении электрохимического поведения золотых пористых ВШЭ в качестве сенсорной платформы для количественного определения олигонуклеотидов и оценке аналитических характеристик разработанного сенсора по отношению к модельным аналитам. Для достижения целей данной работы впервые были изготовлены золотые пористые ВШЭ методом фотолитографии в вакууме. Исследование электрохимического поведения этого нового типа электродов (новой сенсорной платформы) носит фундаментальный характер, так как на основе полученных знаний возможна разработка сенсоров для определения широкого круга аналитов.


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

В данной работе были исследованы возможности золотых пористых встречно- штыревых электродов в качестве сенсорной платформы для количественного определения олигонуклеотидов. Результаты работы привели к следующим выводам:
1. Была проведена характеризация поверхности золотых пористых ВШЭ, специально изготовленных для целей работы: были установлены геометрические размеры штырей (7.5 мкм) и зазоров (4.5 мкм), рассчитана геометрическая площадь рабочей области электрода (7.51*10-3 см2), а также определён диапазон размеров пор (30 - 160 нм).
2. На основе золотых пористых ВШЭ были разработаны двух- и трёхэлектродные сенсоры для количественно определения олигонуклеотида - биомаркера гриппа типа А с регистрацией аналитического сигнала методом спектроскопии электрохимического импеданса.
3. Оба сенсора имеют линейный диапазон от 10-9 М до 10-15 М и предел обнаружения 10-15 М олигонуклеотида - биомаркера гриппа типа А.
4. Чувствительность двухэлектродного сенсора в три раза выше, чем чувствительность трёхэлектродного сенсора: 91.61 Ом/М против 27.07 Ом/М, соответственно.
5. Сравнение трёхэлектродного сенсора на основе пористого ВШЭ с аналогичным сенсором на основе коммерчески-доступного гладкого ВШЭ показало, что сенсор на основе пористого ВШЭ при концентрации аналита 10-9 М позволяет регистрировать в 5 раз больший аналитический сигнал.
Кроме того, следует отметить, что изученные новые электроды - золотые пористые ВШЭ, - являются универсальной сенсорной платформой и могут быть применены для количественного определения множества других биомаркеров опасных заболеваний, а также в качестве сенсорной платформы для разработки газовых сенсоров.



[1] Rahman M.T. et al. Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review // Anwer Khan Mod. Med. Coll. J. 2013. Vol. 4, № 1. P. 30-36.
[2] Kwok S. et al. Identification of human immunodeficiency virus sequences by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection // J. Virol. 1987. Vol. 61, №
5. P. 1690-1694.
[3] Lynas C. et al. Detection of latent virus mRNA in tissues using the polymerase chain reaction // J. Pathol. 1989. Vol. 157, № 4. P. 285-289.
[4] Van Gelder R.N. Applications of the Polymerase Chain Reaction to Diagnosis of Ophthalmic Disease // Surv. Ophthalmol. 2001. Vol. 46, № 3. P. 248-258.
[5] Yamamoto Y. PCR in diagnosis of infection: Detection of bacteria in cerebrospinal fluids // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2002. Vol. 9, № 3. P. 508-514.
[6] Gupta N. et al. Point-of-Care PCR Assays for COVID-19 Detection // Biosensors. 2021. Vol. 11, № 5. P. 141.
[7] Cheng S. et al. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91, № 12. P. 5695-5699.
[8] Wang L., Ji C. Advances in quantitative bioanalysis of oligonucleotide biomarkers and therapeutics // Bioanalysis. 2016. Vol. 8, № 2. P. 143-155.
[9] Vandesompele J. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes // Genome Biol. 2002. Vol. 3, № 7. P 1-12.
[10] Ponchel F. et al. Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions // BMC Biotechnol. 2003. Vol. 3, № 1. P. 1-13.
[11] Pierce K.E., Wangh L.J. Linear-After-The-Exponential Polymerase Chain Reaction and Allied Technologies. 2007. P. 65-85.
[12] Bartel D.P. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function // Cell. 2004. Vol. 116, № 2. P. 281-297.
[13] Verma S., Eckstein F. MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES: Synthesis and Strategy for Users // Annu. Rev. Biochem. 1998. Vol. 67, № 1. P. 99-134.
[14] Yang J. et al. Solid-Phase Synthesis of Phosphorothioate Oligonucleotides Using Sulfurization Byproducts for in Situ Capping // J. Org. Chem. 2018. Vol. 83, № 19. P. 11577¬11585.
[15] Khvorova A., Watts J.K. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility // Nat. Biotechnol. 2017. Vol. 35, № 3. P. 238-248.
[16] Fillon Y.A. et al. Determination of Purge Factors for Use in Oligonucleotide Control Strategies // Org. Process Res. Dev. 2022. Vol. 26, № 4. P. 1130-1144.
[17] Winkler J. Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications // Ther. Deliv. 2013. Vol. 4, № 7. P. 791-809.
[18] Winkler J. et al. 2'-O-Lysylaminohexyl Oligonucleotides: Modifications for Antisense and siRNA // ChemMedChem. 2008. Vol. 3, № 1. P. 102-110.
[19] Noe C.R. et al. Zwitterionic Oligonucleotides: A Study on Binding Properties of 2'- O - Aminohexyl Modifications // Nucleosides. Nucleotides Nucleic Acids. 2005. Vol. 24, № 8. P. 1167-1185.
[20] Chan J.H., Lim S., Wong W.F. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: FROM DESIGN TO THERAPEUTIC APPLICATION // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2006. Vol. 33, № 5¬
6. P. 533-540
[21] Lam J.K.W. et al. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing // Mol. Ther. - Nucleic Acids. 2015. Vol. 4.
[22] Smith C.I.E., Zain R. Therapeutic Oligonucleotides: State of the Art // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2019. Vol. 59, № 1. P. 605-630.
[23] Watson J.D., Crick F.H.C. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953. Vol. 171, № 4356. P. 737-738.
[24] Higuchi R. et al. DNA typing from single hairs // Nature. 1988. Vol. 332, № 6164. P. 543-546.
[25] Jeffreys A.J., Neumann R., Wilson V. Repeat unit sequence variation in minisatellites: A novel source of DNA polymorphism for studying variation and mutation by single molecule analysis // Cell. 1990. Vol. 60, № 3. P. 473-485.
[26] Broude N.E. Stem-loop oligonucleotides: a robust tool for molecular biology and biotechnology // Trends Biotechnol. 2002. Vol. 20, № 6. P. 249-256.
[27] Giudice V. et al. Aptamers and Antisense Oligonucleotides for Diagnosis and Treatment of Hematological Diseases // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, № 9. P. 3252.
[28] Prensner J.R., Chinnaiyan A.M. The Emergence of lncRNAs in Cancer Biology // Cancer Discov. 2011. Vol. 1, № 5. P. 391-407.
[29] Kuribayashi Y. et al. Gene expression analysis by oligonucleotide microarray in oral leukoplakia // J. Oral Pathol. Med. 2009. Vol. 38, № 4. P. 356-361.
[30] Lodes M.J. et al. Detection of Cancer with Serum miRNAs on an Oligonucleotide Microarray // PLoS One. 2009. Vol. 4, № 7. P. e6229.
[31] Wu D. et al. The use of miRNA microarrays for the analysis of cancer samples with global miRNA decrease // RNA. 2013. Vol. 19, № 7. P. 876-888.
[32] Haasnoot J., Westerhout E.M., Berkhout B. RNA interference against viruses: strike and counterstrike // Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 25, № 12. P. 1435-1443.
[33] Herrera-Rodriguez S.E., Elizondo-Quiroga D., Alvarez-Maya I. Infectious diseases detection by microarray: An overview of clinical relevant infections // J. Biomed. Sci. Eng. 2013. Vol. 06, № 10. P. 1006-1013.
[34] Pan Q. et al. Oligonucleotide aptamers: promising and powerful diagnostic and therapeutic tools for infectious diseases // J. Infect. 2018. Vol. 77, № 2. P. 83-98.
[35] Poduri A. et al. Genetic testing in the epilepsies—developments and dilemmas // Nat. Rev. Neurol. 2014. Vol. 10, № 5. P. 293-299.
[36] Perez-Ruiz M. et al. Development and Preliminary Evaluation of a Rapid Oligochromatographic Assay for Specific Detection of New Human Influenza A H1N1 Virus // J. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48, № 5. P. 1801-1805.
[37] Ryabinin V.A. et al. Universal Oligonucleotide Microarray for Sub-Typing of Influenza A Virus // PLoS One. 2011. Vol. 6, № 4. P. e17529.
[38] Alafeef M. et al. Rapid, Ultrasensitive, and Quantitative Detection of SARS-CoV-2 Using Antisense Oligonucleotides Directed Electrochemical Biosensor Chip // ACS Nano. 2020. Vol. 14, № 12. P. 17028-17045.
[39] Sun T. et al. The Role of MicroRNAs in Myocardial Infarction: From Molecular Mechanism to Clinical Application // Int. J. Mol. Sci. 2017. Vol. 18, № 4. P. 745.
[40] Robinson S. et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction // Int. J. Cardiol. 2018. Vol. 257. P. 247-254.
[41] Zemmour H. et al. Non-invasive detection of human cardiomyocyte death using methylation patterns of circulating DNA // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 1443.
[42] Gasc C. et al. OCaPPI-Db: an oligonucleotide probe database for pathogen identification through hybridization capture // Database. 2017. Vol. 2017.
[43] Borner H.G., Lutz J.F. Synthetic-Biological Hybrid Polymers // Polymer Science: A Comprehensive Reference. Elsevier, 2012. P. 543-586.
[44] You K.M. et al. Aptamers as functional nucleic acids:In vitro selection and biotechnological applications // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2003. Vol. 8, № 2. P. 64-75.
[45] Tombelli S., Minunni M., Mascini M. Aptamers-based assays for diagnostics, environmental and food analysis // Biomol. Eng. 2007. Vol. 24, № 2. P. 191-200.
[46] Song S. et al. Aptamer-based biosensors // TrAC Trends Anal. Chem. 2008. Vol. 27, № 2. P. 108-117.
[47] Colon L.A. Analysis of body fluids: urine, blood, saliva and tears // Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. Dordrecht: Springer Netherlands, 1997. P. 486-498.
[48] Strasinger S. K., Di Lorenzo M. S. Urinalysis and body fluids. 6th Edition - FA Davis Company, Philadelphia, 2014.
[49] Sharp V. J. A. et al. Urine Tests. - Springer International Publishing, 2020
[50] Rakel R. Textbook of Family Medicine 8th Edition // Saunders Elsevier: Philadelphia, PA, USA. - 2009
[51] Marx J., Hockberger R., Walls R. Rosen's Emergency Medicine-Concepts and Clinical Practice E-Book: 2-Volume Set. - Elsevier Health Sciences, 2013
[52] Nonaka T., Wong D.T.W. Saliva Diagnostics // Annu. Rev. Anal. Chem. 2022. Vol. 15, № 1. P. 107-121.
[53] Hamada S., Shimosegawa T. Biomarkers of Pancreatic Cancer // Pancreatology. 2011. Vol. 11, № 2. P. 14-19.
[54] Jou Y.-J. et al. Proteomic identification of salivary transferrin as a biomarker for early detection of oral cancer // Anal. Chim. Acta. 2010. Vol. 681, № 1-2. P. 41-48.
[55] Shpitzer T. et al. Salivary analysis of oral cancer biomarkers // Br. J. Cancer. 2009. Vol. 101, № 7. P. 1194-1198.
[56] Park N.J. et al. Salivary microRNA: Discovery, Characterization, and Clinical Utility for Oral Cancer Detection // Clin. Cancer Res. 2009. Vol. 15, № 17. P. 5473-5477.
[57] Miller P.R. et al. Extraction and biomolecular analysis of dermal interstitial fluid collected with hollow microneedles // Commun. Biol. 2018. Vol. 1, № 1. P. 173.
[58] Kiistala U. Suction Blister Device for Separation of Viable Epidermis from Dermis* // J. Invest. Dermatol. 1968. Vol. 50, № 2. P. 129-137.
[59] Weatherby, Dicken, and Scott Ferguson. Blood chemistry and CBC analysis. Vol. 4. Weatherby & Associates, LLC, 2002.
[60] Cai H.Y., Caswell J.L., Prescott J.F. Nonculture Molecular Techniques for Diagnosis of Bacterial Disease in Animals // Vet. Pathol. 2014. Vol. 51, № 2. P. 341-350.
[61] Logan, J., et al. "Current Technology and Applications." Applied and Functional Genomics, Health Protection Agency, London, UK, 2009.
[62] Tomar, Rukam S. Molecular markers and plant biotechnology. New India Publishing, 2010.
[63] Xiu L. et al. A RT-PCR assay for the detection of coronaviruses from four genera // J. Clin. Virol. 2020. Vol. 128. P. 104391.
[64] Espy M.J. et al. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing // Clin. Microbiol. Rev. 2006. Vol. 19, № 1. P. 165-256.
[65] Dhamad A.E., Abdal Rhida M.A. COVID-19: molecular and serological detection methods // PeerJ. 2020. Vol. 8. P. e10180.
[66] Slomka M.J. et al. Validated RealTime reverse transcriptase PCR methods for the diagnosis and pathotyping of Eurasian H7 avian influenza viruses // Influenza Other Respi. Viruses. 2009. Vol. 3, № 4. P. 151-164.
[67] Overbergh L. et al. The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression. // J. Biomol. Tech. 2003. Vol. 14, № 1. P. 33-43.
[68] Dhanasekaran S., Doherty T.M., Kenneth J. Comparison of different standards for real¬time PCR-based absolute quantification // J. Immunol. Methods. 2010. Vol. 354, № 1-2. P. 34-39.
[69] Lu R.-J. et al. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay panel for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 and its variants // Chin. Med. J. (Engl). 2021. Vol. 134, № 17. P. 2048-2053.
[70] Denny P. et al. The Proteomes of Human Parotid and Submandibular/Sublingual Gland Salivas Collected as the Ductal Secretions // J. Proteome Res. 2008. Vol. 7, № 5. P. 1994¬2006.
[71] Saiki R.K. et al. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase // Science. 1988. Vol. 239, № 4839. P. 487-491.
[72] Porta A.R., Enners E. Determining Annealing Temperatures for Polymerase Chain Reaction // Am. Biol. Teach. 2012. Vol. 74, № 4. P. 256-260.
[73] McGinnis A.C., Chen B., Bartlett M.G. Chromatographic methods for the determination of therapeutic oligonucleotides // J. Chromatogr. B. 2012. Vol. 883-884. P. 76-94.
[74] Beverly M. et al. Liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry analysis of the ocular metabolites from a short interfering RNA duplex // J. Chromatogr. B. 2006. Vol. 835, № 1-2. P. 62-70.
[75] Beverly M., Hartsough K., Machemer L. Liquid chromatography/electrospray mass spectrometric analysis of metabolites from an inhibitory RNA duplex // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. Vol. 19, № 12. P. 1675-1682.
[76] Johnson J.L. et al. Quantification of raf antisense oligonucleotide (rafAON) in biological matrices by LC-MS/MS to support pharmacokinetics of a liposome-entrapped rafAON formulation // Biomed. Chromatogr. 2005. Vol. 19, № 4. P. 272-278.
[77] Kasai K. Size-dependent chromatographic separation of nucleic acids // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1993. Vol. 618, № 1-2. P. 203-221.
[78] Chen S.-H. et al. Determination of antisense phosphorothioate oligonucleotides and catabolites in biological fluids and tissue extracts using anion-exchange high-performance liquid chromatography and capillary gel electrophoresis // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1997. Vol. 692, № 1. P. 43-51.
[79] Bigelow J.C. et al. High-performance liquid chromatographic analysis of phosphorothioate analogues of oligodeoxynucleotides in biological fluids // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1990. Vol. 533. P. 133-140.
[80] Goyon A., Yehl P., Zhang K. Characterization of therapeutic oligonucleotides by liquid chromatography // J. Pharm. Biomed. Anal. 2020. Vol. 182. P. 113105.
[81] Huber C.G. et al. High-resolution liquid chromatography of DNA fragments on non- porous poly(styrene-divinylbenzene) particles // Nucleic Acids Res. 1993. Vol. 21, № 5. P. 1061-1066.
[82] Huber C.G., Oberacher H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography¬Mass spectrometry // Mass Spectrom. Rev. 2001. Vol. 20, № 5. P. 310-343.
[83] Huang M. et al. Analytical characterization of DNA and RNA oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2021. Vol. 1648. P. 462184.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.