Биотехнологический синтез серосодержащих полигидроксиалканоатов бактериями Cupriavidus necator B-10646и их свойства
|
РЕФЕРАТ 2
СОДЕРЖАНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Синтетические полимеры 8
1.2 Биоразрушаемые полимеры - общая характеристика 9
1.3 Полигидроксиалканоаты, их свойства и применение 11
1.4. Сополимерные ПГА 12
1.5 Серосодержащие полимеры 13
1.5.1. Химические и физические свойства ПТЭ 14
1.5.2. Микроорганизмы-продуценты политиоэфиров 14
1.5.3. Биоинтез политиоэфиров 17
1.6 Деградация ПТЭ 19
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 21
2.1 Бактериальный штамм и получение инокулята 21
2.2 Культивирование бактерий 21
2.3 Регистрация параметров культивирования 22
2.3.1 Определение оптической плотности 22
2.3.2 Определение концентрации субстрата 23
2.3.3 Определение бактериальной биомассы 23
2.4 Определение содержания и состава полимера 24
2.5 Исследование физико-химических свойств полимера 24
2.5.1 Определение молекулярной массы ПГА 24
2.5.2 Степень кристалличности 25
2.5.4 Определение температурных характеристик полимера 25
2.6 Статистическая обработка результатов 25
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 41
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 42
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 43
СОДЕРЖАНИЕ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Синтетические полимеры 8
1.2 Биоразрушаемые полимеры - общая характеристика 9
1.3 Полигидроксиалканоаты, их свойства и применение 11
1.4. Сополимерные ПГА 12
1.5 Серосодержащие полимеры 13
1.5.1. Химические и физические свойства ПТЭ 14
1.5.2. Микроорганизмы-продуценты политиоэфиров 14
1.5.3. Биоинтез политиоэфиров 17
1.6 Деградация ПТЭ 19
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 21
2.1 Бактериальный штамм и получение инокулята 21
2.2 Культивирование бактерий 21
2.3 Регистрация параметров культивирования 22
2.3.1 Определение оптической плотности 22
2.3.2 Определение концентрации субстрата 23
2.3.3 Определение бактериальной биомассы 23
2.4 Определение содержания и состава полимера 24
2.5 Исследование физико-химических свойств полимера 24
2.5.1 Определение молекулярной массы ПГА 24
2.5.2 Степень кристалличности 25
2.5.4 Определение температурных характеристик полимера 25
2.6 Статистическая обработка результатов 25
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 41
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 42
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 43
Полигидроксиалканоаты (ПГА) являются внутриклеточными запасными полимерами, которые накапливаются большим количеством бактерий при дефиците азота, фосфора на фоне высокого содержания углеродного субстрата. Биодеградируемые ПГА являются альтернативными претендентами на замену пластикам, которые получены из нефти, и накопление их в биосфере представляет собой глобальную экологическую проблему [1-6]. Поэтому переход на новые биоразлагаемые материалы, которые разрушаются в среде до углекислого газа и воды и не наносят вреда биосфере, является актуальным направлением в биотехнологии.
ПГА являются группой биополимеров разнообразного химического состава, которые синтезируются прокариотами на различных источниках углерода. Физико-химические свойства ПГА, такие как: молекулярная масса, температурные характеристики, степень кристалличности, скорость разложения в биологических средах и др. и возможность переработки в специализированные изделия варьируются из-за строения мономерных звеньев ПГА [54].
Первым идентифицированным полимером из класса ПГА и наиболее полно охарактеризованным и коммерчески производимым является поли(3 - гидроксибутират) П(3ГБ), который представляет собой высококристалличный полиэфир. Сополимер 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом П(3ГБ-со- 3ГВ) стал вторым наиболее активно изучаемым представителем семейства ПГА после П(3ГБ). Встраивание 3- гидроксивалерата в углеродную цепь 3ГБ оказывает значительное влияние на скорость кристаллизации материала, а с увеличением его содержания материал становится менее кристалличным и более эластичным [7]. Сополимеры 3-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата П(3ГБ-со-4ГБ) - это эластомеры и их удлинение при разрыве может составлять 1000%. Данный показатель почти в 100 раз больше, чем у гомополимера П(3ГБ). При включении мономеров 4ГБ в сополимер более 50 мол.%, что 5
является высоким показателем, наблюдается только один тип кристаллической решетки и мономеры 4ГБ не входят в решетку 3ГБ [8].
В зависимости от длины углеродной цепи мономеры в ПГА можно разделить на:
1. короткоцепочечные (SCL): состоят из кислот с длиной углеродной цепи от 3 до 5 атомов углерода;
2. полимеры со средней длиной цепи (MCL): состоят от 6 до 14 атомов углерода;
3. длинноцепочечные (LCL), содержащие мономеры с длиной углеродной цепи от 17 и выше [9].
Набор изученных и известных ПГА со временем расширяется. Olivera et al. в 2010 г. предложили разделить ПГА на две категории в соответствии с частотой возникновения: «обычные» и «необычные» [10].
Потенциальная способность создания биополимеров разнообразного строения, в состав которых входят мономеры с различной длиной углеродной цепи, является особо важным свойством ПГА, поскольку основные свойства, особенно кристалличность, изменяется в довольно широком диапазоне в зависимости от соотношения мономеров [7-15]. Многообразие возможных путей синтеза ПГА [1] в различных микроорганизмах с использованием широкого спектра источников углерода - реальная основа для синтеза обширного спектра биополимеров различного химического состава.
Недавно группа ученых обнаружила новый класс биополимеров. Культивирование грамотрицательной бактерии Ralstonia eutrophaпроводили с добавлением 3-меркаптоалкановой кислоты или 3,3'-тиодипропионовой кислоты, в результате чего получили сополимеры, которые состояли из 3- меркаптопропионата(3МП) и 3ГБ. До сих пор 3-меркаптопропионовая кислота [16] и 3-меркаптомасляная кислота [17] были описаны как составляющие новых ПТЭ.
Политиоэфиры(ПТЭ) - класс ПГА, который содержит атомы серы в С¬цепи. Они относятся к «необычным» и малоизученным типам ПГА. Микробные ПТЭ являются материалами с особенными свойствами, например для них характерны сложные процессы кристаллизации по сравнению с большинством известных типов ПГА. Температура плавления П(3МП) стремится к температуре плавления П(3ГБ), но поли(З-меркаптопропионат) проявляет большую термическую стабильность. Ко всему выше сказанному было получено, что сополимеры этого типа обладают антибактериальными свойствами [18,19]. Высокая термическая стабильность П(3МП) по сравнению с другими известными мономерами сочетается с особенным для семейства ПГА свойством - отсутствием биоразлагаемости. С одной стороны, эта особенность ПТЭ уменьшает область их применения как подающий надежды биоразлагаемый полимерный материал по сравнению с большинством известных ПГА, но, с другой стороны, раскрывает новые перспективы, такие как: применение в строительстве, автомобильной сборке и фотоэлектрических элементах. Кроме того, обсуждается возможность использования этих видов ПГА в качестве биосовместимого антибактериального материала в регенеративной медицине, когда биосовместимые эндопротезы должны функционировать в организме длительное время [20,21].
Целью работы было изучение условий синтеза серосодержащих полигидроксиалканоатов в культуре природного штамма Cupriavidus necatorВ- 10646 и выявление взаимосвязи между составом и физико-химическими свойствами синтезируемых полимеров.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние различных концентраций прекурсоров на рост Cupriavidus necator B-10646 и синтез политиоэфиров;
2. Изучить влияние дробного внесения прекурсоров в питательную среду на рост бактериальной культуры Cupriavidus necator В-10646 и синтез политиоэфиров;
3. Изучить физико-химические свойства синтезированных сополимеров П(3ГБ-со-3МП).
ПГА являются группой биополимеров разнообразного химического состава, которые синтезируются прокариотами на различных источниках углерода. Физико-химические свойства ПГА, такие как: молекулярная масса, температурные характеристики, степень кристалличности, скорость разложения в биологических средах и др. и возможность переработки в специализированные изделия варьируются из-за строения мономерных звеньев ПГА [54].
Первым идентифицированным полимером из класса ПГА и наиболее полно охарактеризованным и коммерчески производимым является поли(3 - гидроксибутират) П(3ГБ), который представляет собой высококристалличный полиэфир. Сополимер 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом П(3ГБ-со- 3ГВ) стал вторым наиболее активно изучаемым представителем семейства ПГА после П(3ГБ). Встраивание 3- гидроксивалерата в углеродную цепь 3ГБ оказывает значительное влияние на скорость кристаллизации материала, а с увеличением его содержания материал становится менее кристалличным и более эластичным [7]. Сополимеры 3-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата П(3ГБ-со-4ГБ) - это эластомеры и их удлинение при разрыве может составлять 1000%. Данный показатель почти в 100 раз больше, чем у гомополимера П(3ГБ). При включении мономеров 4ГБ в сополимер более 50 мол.%, что 5
является высоким показателем, наблюдается только один тип кристаллической решетки и мономеры 4ГБ не входят в решетку 3ГБ [8].
В зависимости от длины углеродной цепи мономеры в ПГА можно разделить на:
1. короткоцепочечные (SCL): состоят из кислот с длиной углеродной цепи от 3 до 5 атомов углерода;
2. полимеры со средней длиной цепи (MCL): состоят от 6 до 14 атомов углерода;
3. длинноцепочечные (LCL), содержащие мономеры с длиной углеродной цепи от 17 и выше [9].
Набор изученных и известных ПГА со временем расширяется. Olivera et al. в 2010 г. предложили разделить ПГА на две категории в соответствии с частотой возникновения: «обычные» и «необычные» [10].
Потенциальная способность создания биополимеров разнообразного строения, в состав которых входят мономеры с различной длиной углеродной цепи, является особо важным свойством ПГА, поскольку основные свойства, особенно кристалличность, изменяется в довольно широком диапазоне в зависимости от соотношения мономеров [7-15]. Многообразие возможных путей синтеза ПГА [1] в различных микроорганизмах с использованием широкого спектра источников углерода - реальная основа для синтеза обширного спектра биополимеров различного химического состава.
Недавно группа ученых обнаружила новый класс биополимеров. Культивирование грамотрицательной бактерии Ralstonia eutrophaпроводили с добавлением 3-меркаптоалкановой кислоты или 3,3'-тиодипропионовой кислоты, в результате чего получили сополимеры, которые состояли из 3- меркаптопропионата(3МП) и 3ГБ. До сих пор 3-меркаптопропионовая кислота [16] и 3-меркаптомасляная кислота [17] были описаны как составляющие новых ПТЭ.
Политиоэфиры(ПТЭ) - класс ПГА, который содержит атомы серы в С¬цепи. Они относятся к «необычным» и малоизученным типам ПГА. Микробные ПТЭ являются материалами с особенными свойствами, например для них характерны сложные процессы кристаллизации по сравнению с большинством известных типов ПГА. Температура плавления П(3МП) стремится к температуре плавления П(3ГБ), но поли(З-меркаптопропионат) проявляет большую термическую стабильность. Ко всему выше сказанному было получено, что сополимеры этого типа обладают антибактериальными свойствами [18,19]. Высокая термическая стабильность П(3МП) по сравнению с другими известными мономерами сочетается с особенным для семейства ПГА свойством - отсутствием биоразлагаемости. С одной стороны, эта особенность ПТЭ уменьшает область их применения как подающий надежды биоразлагаемый полимерный материал по сравнению с большинством известных ПГА, но, с другой стороны, раскрывает новые перспективы, такие как: применение в строительстве, автомобильной сборке и фотоэлектрических элементах. Кроме того, обсуждается возможность использования этих видов ПГА в качестве биосовместимого антибактериального материала в регенеративной медицине, когда биосовместимые эндопротезы должны функционировать в организме длительное время [20,21].
Целью работы было изучение условий синтеза серосодержащих полигидроксиалканоатов в культуре природного штамма Cupriavidus necatorВ- 10646 и выявление взаимосвязи между составом и физико-химическими свойствами синтезируемых полимеров.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние различных концентраций прекурсоров на рост Cupriavidus necator B-10646 и синтез политиоэфиров;
2. Изучить влияние дробного внесения прекурсоров в питательную среду на рост бактериальной культуры Cupriavidus necator В-10646 и синтез политиоэфиров;
3. Изучить физико-химические свойства синтезированных сополимеров П(3ГБ-со-3МП).
Показано, что, варьируя концентрацию и количество доз предшественника 3МП, вносимого в бактериальную культуру Cupriavidus necator B-10646,удалось найти условия, обеспечивающие образование мономеров 3-меркаптопропионата (3МП) из предшественников (3- меркаптопропионовой, 3,3'-тиодипропионовой и 3,3'-дитиодипропионовой кислот) и включение их в С-цепь, поли(3-гидроксибутирата).
Получен набор сополимеров с различным содержанием 3- гидроксибутирата (от 60,01 мол.% до 97,96 мол.%) и включений 3- меркаптопропионата (от 2,04 мол.% до 39,0 мол.%).
Проведены исследования, позволившие выявить зависимость между содержанием 3МП и их физико-химическими свойствами. Представлено, что новые типы мономеров (3МП) в составе ПГА действуют на молекулярную массу, температурные характеристики и степень кристалличности синтезируемых сополимеров. Также, нами был получен значительный результат действия новых мономеров на свойства ПГА, заключающийся в выравнивании аморфной и упорядоченной фаз и значительном снижении степени кристалличности (ниже 50%) у полученных в ходе экспериментов образцов сополимера. Снижение степени кристалличности образцов ПГА положительно сказывается на их свойствах и кинетики кристаллизации, что облегчает переработку в специализированные продукты, улучшая технологические свойства
Получен набор сополимеров с различным содержанием 3- гидроксибутирата (от 60,01 мол.% до 97,96 мол.%) и включений 3- меркаптопропионата (от 2,04 мол.% до 39,0 мол.%).
Проведены исследования, позволившие выявить зависимость между содержанием 3МП и их физико-химическими свойствами. Представлено, что новые типы мономеров (3МП) в составе ПГА действуют на молекулярную массу, температурные характеристики и степень кристалличности синтезируемых сополимеров. Также, нами был получен значительный результат действия новых мономеров на свойства ПГА, заключающийся в выравнивании аморфной и упорядоченной фаз и значительном снижении степени кристалличности (ниже 50%) у полученных в ходе экспериментов образцов сополимера. Снижение степени кристалличности образцов ПГА положительно сказывается на их свойствах и кинетики кристаллизации, что облегчает переработку в специализированные продукты, улучшая технологические свойства