Реферат 3
Введение 4
1 Обзор литературы 5
1.1 Роль микроорганизмов в жизни людей 5
1.2 Роль микроорганизмов при заболеваниях 6
1.3 Роль микроорганизмов для здоровья человека 8
1.4 История развития методов идентификации микроорганизмов 11
1.5 Классификация методов идентификации микроорганизмов 14
1.6 Современные методы идентификации бактерий 15
1.7 Метод масс-спектрометрии 19
1.8 Генетические методы 22
1.9 Метод ARDRA 25
2 Материалы и методы 27
2.1 Объекты 27
2.2 Методика анализа in silico 27
2.2 Метод получения чистой культуры 27
2.3 Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду 28
2.4 Методика выделения ДНК 29
2.5 Методика проведения полимеразной цепной реакции 30
2.6 Методика проведения электрофореза 30
2.7 Проведение реакции рестрикции 32
3 Результаты и обсуждение 33
3.1 Результаты получения чистых культур бактерий 33
3.2 Выделение ДНК из биомассы бактерий 33
3.2 Получение ампликонов гена 16S рРНК 36
3.3 Результаты реакций рестрикции 37
3.4 Результаты анализа in silico 38
3.5 Сравнение теоретических и практических электрофореграмм 40
Заключение 45
Список использованных источников 46
В современной биотехнологии широко используются свойства микроорганизмов. В то же время микроорганизмы, обладающие полезными для человека свойствами, могут иметь и патогенные свойства. Поэтому, перед тем как начать использовать новые организмы, очень важно их правильно идентифицировать. Наравне с традиционными методами идентификации микроорганизмов, в последнее время повсеместно используют методы определения, связанные с изучением ДНК микроорганизмов, которая является важнейшим объектом исследований в молекулярной биологии и биохимии.
Цель работы: Изучить и сравнить методы идентификации микроорганизмов, определить вид полученных образцов бактерий.
Задачи:
1. Выделить чистые культуры из образцов смешанных культур бактерий и выделить ДНК из биомассы чистых культур.
2. Получить ампликоны гена 16S рРНК и провести рестрикционный анализ этих ампликонов.
3. Провести анализ in silicoпредполагаемых видов бактерий с использованием данных GenBank.
4. Сравнить теоретические и экспериментальные электрофореграммы и идентифицировать бактерии.
5. Проверить достоверность идентификации полученных нами чистых культур микроорганизмов методом MALDI-TOF.
В ходе работы были получены чистые культуры двенадцати образцов бактерий. Из них была выделена и очищена ДНК. Используя пары праймеров 8F и 1492R были получены ампликоны гена 16S рРНК, соответствующие длине около 1500 п.о. С полученными ампликонами были проведены реакции рестрикции. Сравнение полученных нами экспериментальных электрофореграмм с теоретическими из нашей базы данных выявило, что исследованные образцы бактерий являются представителями следующих видов: Arthrobacter aurescens, Bacillus pumilus, Microbacterium phyllosphaerae, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Arthrobacter globiformes, Micrococcus luteus, Achromobacter xyloxidans, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Pseudomonas fluorescens, Arthrobacter globiformis.
Данные, полученные в ходе наших экспериментов, были сверены с результатами, полученными методом масс-спектрометрии MALDI-TOF. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов показал совпадение по определению десяти из исследованных видов с результатами, полученными методом MALDI-TOF. В двух случаях нам удалось уточнить данные, полученные методом масс спектроскопии.
По результатам сравнения было выяснено, что оба метода имеют хорошую достоверность данных.
