РЕФЕРАТ 2
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1. Ферментативные биотесты и способы конструирования ферментативных реагентов 7
1.1. Использование ферментов в методах биодиагностики 7
1.2. Биолюминесцентные ферментативные тесты 11
1.3. Стабилизация ферментов 14
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20
2.1. Реактивы и приборы 20
2.2. Метод получения многокомпонентного иммобилизованного реагента .... 21
2.3. Методика измерения активности многокомпонентного
иммобилизованного реагента 22
2.4. Исследование чувствительности многокомпонентного
иммобилизованного реагента к действию токсикантов 22
2.5. Статистическая обработка результатов экспериментов 23
3.1. Оценка активности многокомпонентного реагента в зависимости от
состава дисков и режима высушивания Ошибка! Закладка не определена.
3.1.1. Оценка активности многокомпонентного реагента в зависимости от количества ферментов в дисках и режима высушивания ..Ошибка! Закладка не определена.
3.1.2. Оценка активности многокомпонентного реагента в зависимости от
концентрации NADH Ошибка! Закладка не определена.
3.1.3. Оценка активности многокомпонентного иммобилизованного реагента в
зависимости от концентрации тетрадеканаля Ошибка! Закладка не
определена.
3.2. Оценка чувствительности многокомпонентного иммобилизованного реагента в зависимости от состава дисков ... Ошибка! Закладка не определена.
3.2.1. Оценка чувствительности многокомпонентного иммобилизованного реагента в зависимости от количества фермента Ошибка! Закладка не
определена.
3.2.2. Оценка чувствительности многокомпонентного иммобилизованного
реагента в зависимости от концентрации NADH Ошибка! Закладка не
определена.
3.2.3. Оценка чувствительности многокомпонентного иммобилизованного реагента в зависимости от концентрации тетрадеканаля ..Ошибка! Закладка не определена.
3.3. Анализ кинетических характеристик многокомпонентного
иммобилизованного реагента Ошибка! Закладка не определена.
3.4. Определение активности многокомпонентного иммобилизованного
реагента в зависимости от времени хранения Ошибка! Закладка не
определена.
3.5. Оценка активности многокомпонентного иммобилизованного реагента в зависимости от количества FMN в реакционной смеси ....Ошибка! Закладка не определена.
3.6. Оценка вариабельности многокомпонентных иммобилизованных реагентов внутри партии в зависимости от состава диска Ошибка! Закладка не определена.
ВЫВОДЫ 25
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 26
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 27
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 28
Экологическое состояние Земли испытывает огромный ущерб вследствие антропогенного и техногенного факторов загрязнения. Количество видов токсических веществ ежегодно возрастает и, как следствие, губительно отражается на различных видах организмов и экологической обстановке в целом. Поэтому одной из важнейших задач последних десятилетий является мониторинг загрязнения окружающей среды. Традиционно для мониторинга загрязнения окружающей среды применяются химические методы, однако данные методы не могут оценить токсическое влияние на объекты живой природы. Поэтому для предупреждения загрязнения и предотвращения его последствий мировое научное сообщество развивает различные биологические методы тестирования токсичных веществ, но они довольно длительны и затратны.
Актуальным остаётся поиск быстрых методов оценки состояния окружающей среды. Таким методом является анализ токсичности образцов на основе биолюминесцентной биферментной системы светящихся бактерий ПАП(Р)Н:РМЫ-оксидоредуктаза и люцифераза (R + L), катализирующей последовательность реакций, в которых энергия химических связей трансформируется в световую. Для более широкого применения ферментов светящихся бактерий в методах экологического биотестирования (оценки качества воды, воздуха и почвы) необходимо получение на их основе стабильных реагентов, при сохранении чувствительности к действию токсических веществ на уровне ПДК.
На данный момент известно несколько способов стабилизации ферментов, из которых наиболее оптимальным является их иммобилизация. Несомненно, иммобилизация ферментов позволяет получать стабильные при хранении и использовании реагенты, удобные для проведения биолюминесцентного анализа. Разработаны коммерческие препараты, представляющие собой биферментную систему R + L, иммобилизованную совместно с субстратами в крахмальный гель, но их чувствительность к действию разным классам токсических веществ значительно ниже в сравнении с растворимыми ферментами. Ещё одной нерешённой проблемой является проблема сохранения активности реагента при хранении.
Цель работы состояла в оптимизации состава многокомпонентного иммобилизованного реагента для достижения его высокой чувствительности к действию токсических веществ и стабильности при длительном хранении и использовании...
В работе исследовано влияние состава многокомпонентного иммобилизованного реагента на характеристики биферментной системы R+L, иммобилизованной совместно с субстратами в крахмальный гель. Был выбран оптимальный режим высушивания реагентов для достижения меньшей вариабельности значений максимального свечения.
Иммобилизованный реагент оптимизированного состава отличается наибольшей чувствительностью к действию CuSO4, соответствуя чувствительности растворимой системе R+L. Данный реагент позволяет определять концентрацию медного купороса на уровне ПДК. Чувствительность реагента к глифосату не соответствует ПДК пестицида и в 2 раза превышает значения IC50 растворимой R+L системы.
Установлено, что положение планшетов при высушивании реагентов не влияют на конечную активность дисков.
Оптимизация состава позволила увеличить срок хранения многокомпонентного иммобилизованного реагента, что способствует расширению применения биолюминесцентного иммобилизованного реагента в качестве тест-системы для экологического мониторинга.
