Тип работы:
Предмет:
Язык работы:


Разработка нового генетически кодируемого флуоресцентного зеленого сенсора на аминокислоту изолейцин

Работа №164859

Тип работы

Магистерская диссертация

Предмет

биология

Объем работы67
Год сдачи2024
Стоимость4200 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
23
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Генетически кодируемые флуоресцентные белки 6
1.2 Кальциевые сенсоры на основе зеленых флуоресцентных белков .. 8
2.1.1 Состав и строение сенсоров 11
2.1.2 Параметры кальциевых сенсоров 16
2.1.3 Зеленые кальциевые индикаторы на основе EGFP и niNeonGreen 18
3.1 Аминокислотные сенсоры 20
3.1.1 Датчики глюкозы 20
3.1.2 Датчики пирувата и лактата 21
3.1.3 Датчик цитрата 23
3.1.4 Глутамин и альфа-кето глутарат 24
3.1.5 Глутамат 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВНИЯ 28
2.1 Материалы исследования 28
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Амплификация фрагментов ДНК, рестрикция, электрофорез в
агарозном геле, лигирование и очистка 30
2.2.2 Сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР с
перекрывающимися фрагментами 33
2.2.3 Создание библиотек случайных мутантов 34
2.2.4 Трансформация бактериальных клеток 35
2.2.5 Скрининг библиотек 36
2.2.6 Исследование первичной структуры белков 38
2.2.7 Очистка белка и характеристика его свойств in vitroв растворе... 39
2.2.7.1 Определение времени созревания 40
2.2.8 Создание конструкций для временной трансфекции культур клеток
млекопитающих 42
2.2.9 Культивирование и трансфекция культур клеток 42
2.2.10 Флуоресцентная микроскопия 43
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
ЗЛ Разработка генетически кодируемого индикатора на изолейцин на основе флуоресцентного белка mNeonGreen и лейцин-изолейцин-валин связывающего белка LIV ВР 44
3.2 Характеризация индикатора на изолейцин Nelle на очищенном
белке in vitro 49
3.3 Визуализация индикатора на изолейцин Nelle в различных
органеллах клеток млекопитающих 53
3.4 Кристаллическая структура индикатора Nelle в связанном с
изолейцином состоянии 57
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 61
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 62

Актуальность исследования. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры стали незаменимыми инструментами биологических исследований, позволяющими в режиме реального времени наблюдать за физиологическими процессами в живых клетках. Недавние усилия в области белковой инженерии привели к созданию большого разнообразия флуоресцентных биосенсоров для широкого спектра биологически значимых процессов.
Детекция незаменимых аминокислот важна для их промышленного производства, особенно 8-ми аминокислот: валина, изолейцина, лейцина, метионина, треонина, триптофана, фенилаланина и лизина. Для высокопроизводительного скрининга штаммов-суперпродуцентов
аминокислот, необходимо проводить мониторинг таких аминокислот на клеточном уровне. Аминокислоты могут выполнять роль нейромедиаторов и нейро модуляторов в головном мозге, однако их роль остается малоизученной из-за отсутствия необходимых методов прижизненной детекции. Для решения этих задач необходимо разработать флуоресцентные генетически кодируемые аминокислотные индикаторы (ГКАИ).
До сих пор были получены ГКАИ на основе FRET (Фёрстеровского резонансного переноса энергии). Сенсоры FRET на основе флуоресцентных белков стали мощным инструментом для исследования белок-белковых взаимодействий и структурных изменений внутри белков. Но такие индикаторы имеют ограниченный флуоресцентный ответ на добавление аминокислот (меньше 100%) и требуют дорогостоящего оборудования, осложняя детекцию сигнала in vivo.Они содержат в своем составе два флуоресцентных белка, что существенно увеличивает их размер и ограничивает спектральный диапазон.
Все вышеупомянутое позволило выявить цель и задачи исследования.
Цель работы — разработка сенсора на изолейцин с оптимальным дизайном на основе одного яркого мономерного циркулярно- пермутированного белка mNeonGreen в качестве флуоресцентной части и изолейцин-валин-лейцин-связывающего белка LIVBP.
Для реализации поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Провести несколько раундов скрининга по увеличению контраста, яркости и специфичности.
2. Охарактеризовать свойства сенсора Nelle в растворе in vitro.
3. Охарактеризовать свойства сенсора Nelle в животных клетках.
Выпускная квалификационная работа написана на 67 листах , содержит 20 рисунков, 1 таблицу и список литературы, состоящий из 50 источников.


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!


Таким образом, в ходе выполнения магистерской диссертации разработан сенсор на изолейцин с оптимальным дизайном на основе одного яркого мономерного циркулярно-пермутированного белка mNeonGreen в качестве флуоресцентной части и изолейцин-валин-лейцин-связывающего белка LIVBP.
Исходя из полученных результатов, можно сделать следующие выводы:
1. Разработан генетически кодируемый интенсио метрический индикатор на изолейцин Nelle на основе одного зеленого флуоресцентного белка, который позволяет детектировать аминокислоту изолейцин, и с меньшей чувствительностью, лейцин и валин in vitro.
2. Спектральные свойства, молекулярная яркость, олигомерное состояние, период полусозревания, фототабильность сенсора охарактеризованы in vitroв растворе. Исходя из полученных данных, индикатор Nelle является мономерным и может быть использован для мечения белков в органеллах животных клеток.
3. Разработанный индикатор Nelle и его радиометрическая версия были успешно проэкспрессированы в различных органеллах животных клеток.
Таким образом, индикатор Nelle является первым мономерным генетически кодируемым зелёным флуоресцентным индикатором на основе одного флуоресцентного белка с высоким контрастом на изолейцин. Разработанный индикатор Nelle открывает возможность высокопродуктивного скрининга для создания бактериальных штаммов- суперпродуцентов незаменимой аминокислоты изолейцина и изучения роли изолейцина в качестве потенциального нейромедиатора или нейромодулятора в головном мозге.



1. Ameen, S., Ahmad, M., Mohsin, M., Qureshi, M. I., Ibrahim, M. M., Abdin, M. Z., Ahmad, A. Designing, construction and characterization of genetically encoded FRET-based nanosensor for real time monitoring of lysine flux in living cells // Journal of nanobiotechnology. 2016. № 14. C. 49.
2. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.№96.C. 11241-11246.
3. Barykina N. V., Subach О. M., Doronin D. A. A new design for a green calcium indicator with a smaller size and a reduced number of calcium-binding sites. // Scientific Reports. 2016. № 34447.
4. Chen T.W., Wardill T.J., Sun Y. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity//Nature. 2013. № 7458. C. 295-300.
5. Clavel D, Gotthard G, von Stetten D, et al. Structural analysis of the bright monomeric yellow-green fluorescent protein mNeoiiGreen obtained by directed evolution. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2016
6. Doronin D. A., Barykina N. V., Subach О. M. Genetically encoded calcium indicator with NTnC-like design and enhanced fluorescence contrast and kinetics. // BMC Biotechnology. 2018. №. 10.
7. Fehr M, Frommer WB, Lalonde S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors / / Proc Natl Acad Sci USA. 2002. № 99. C. 9846-9851.
8. Fehr M, Lalonde S, Lager I, Wolff MW, Frommer WB In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. //J Biol Chem. 2003. № 278. C. 19127-19133.
9. Felder CB, Graul RC, Lee AY. The venus flytrap of periplasmic binding proteins: an ancient protein module present in multiple drug receptors // AAPS Pharm Sci .1999. № 23
10. Fukami-Kobayashi К, Tat eno Y, Nishikawa К Domain dislocation: a change of core structure in periplasmic binding proteins in their evolutionary history. // J Mol Biol. 1999. № 286. C. 279-290.
11. Grist, J. P., Josey, S. A. Inverse analysis adjustment of the SOC air-sea flux climatology using ocean heat transport constraints. Journal of Climate, 16(20), 2003;3274-3295.
12. Grunwald Niklaus J.: Genome sequences of Phytophthora enable translational plant disease management and accelerate research, Canadian Journal of Plant Pathology, 34:1,2012; 13-19.
13. Honda Y., KirimuraK. Generation of Circularly Permuted Fluorescent- Protein-Based Indicators for In Vitro and In Vivo Detection of Citrate. PLOS ONE 8(11): 10. 2013; 1371.
14. Lager I, Fehr M, Frommer WB, Lalonde S: Development of a fluorescent nanosensor for ribose. / / FEBS Lett. 2003. № 553. C. 85-89.
15. Lambert G. G., Depemet H. Aequorea victoria’s secrets // BioXriv -
2019.
...
50 источников


Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ