📄Работа №164859
Тема: Разработка нового генетически кодируемого флуоресцентного зеленого сенсора на аминокислоту изолейцин
Тип работы
Магистерская диссертация
Предмет
биология
Объем:
67 листов
Год:
2024
Просмотров:
69
4200
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Генетически кодируемые флуоресцентные белки 6
1.2 Кальциевые сенсоры на основе зеленых флуоресцентных белков .. 8
2.1.1 Состав и строение сенсоров 11
2.1.2 Параметры кальциевых сенсоров 16
2.1.3 Зеленые кальциевые индикаторы на основе EGFP и niNeonGreen 18
3.1 Аминокислотные сенсоры 20
3.1.1 Датчики глюкозы 20
3.1.2 Датчики пирувата и лактата 21
3.1.3 Датчик цитрата 23
3.1.4 Глутамин и альфа-кето глутарат 24
3.1.5 Глутамат 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВНИЯ 28
2.1 Материалы исследования 28
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Амплификация фрагментов ДНК, рестрикция, электрофорез в
агарозном геле, лигирование и очистка 30
2.2.2 Сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР с
перекрывающимися фрагментами 33
2.2.3 Создание библиотек случайных мутантов 34
2.2.4 Трансформация бактериальных клеток 35
2.2.5 Скрининг библиотек 36
2.2.6 Исследование первичной структуры белков 38
2.2.7 Очистка белка и характеристика его свойств in vitroв растворе... 39
2.2.7.1 Определение времени созревания 40
2.2.8 Создание конструкций для временной трансфекции культур клеток
млекопитающих 42
2.2.9 Культивирование и трансфекция культур клеток 42
2.2.10 Флуоресцентная микроскопия 43
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
ЗЛ Разработка генетически кодируемого индикатора на изолейцин на основе флуоресцентного белка mNeonGreen и лейцин-изолейцин-валин связывающего белка LIV ВР 44
3.2 Характеризация индикатора на изолейцин Nelle на очищенном
белке in vitro 49
3.3 Визуализация индикатора на изолейцин Nelle в различных
органеллах клеток млекопитающих 53
3.4 Кристаллическая структура индикатора Nelle в связанном с
изолейцином состоянии 57
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 61
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 62
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Генетически кодируемые флуоресцентные белки 6
1.2 Кальциевые сенсоры на основе зеленых флуоресцентных белков .. 8
2.1.1 Состав и строение сенсоров 11
2.1.2 Параметры кальциевых сенсоров 16
2.1.3 Зеленые кальциевые индикаторы на основе EGFP и niNeonGreen 18
3.1 Аминокислотные сенсоры 20
3.1.1 Датчики глюкозы 20
3.1.2 Датчики пирувата и лактата 21
3.1.3 Датчик цитрата 23
3.1.4 Глутамин и альфа-кето глутарат 24
3.1.5 Глутамат 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВНИЯ 28
2.1 Материалы исследования 28
2.2 Методы исследования 30
2.2.1 Амплификация фрагментов ДНК, рестрикция, электрофорез в
агарозном геле, лигирование и очистка 30
2.2.2 Сайт-специфический мутагенез с помощью ПЦР с
перекрывающимися фрагментами 33
2.2.3 Создание библиотек случайных мутантов 34
2.2.4 Трансформация бактериальных клеток 35
2.2.5 Скрининг библиотек 36
2.2.6 Исследование первичной структуры белков 38
2.2.7 Очистка белка и характеристика его свойств in vitroв растворе... 39
2.2.7.1 Определение времени созревания 40
2.2.8 Создание конструкций для временной трансфекции культур клеток
млекопитающих 42
2.2.9 Культивирование и трансфекция культур клеток 42
2.2.10 Флуоресцентная микроскопия 43
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 44
ЗЛ Разработка генетически кодируемого индикатора на изолейцин на основе флуоресцентного белка mNeonGreen и лейцин-изолейцин-валин связывающего белка LIV ВР 44
3.2 Характеризация индикатора на изолейцин Nelle на очищенном
белке in vitro 49
3.3 Визуализация индикатора на изолейцин Nelle в различных
органеллах клеток млекопитающих 53
3.4 Кристаллическая структура индикатора Nelle в связанном с
изолейцином состоянии 57
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 61
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 62
📖 Введение
Актуальность исследования. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры стали незаменимыми инструментами биологических исследований, позволяющими в режиме реального времени наблюдать за физиологическими процессами в живых клетках. Недавние усилия в области белковой инженерии привели к созданию большого разнообразия флуоресцентных биосенсоров для широкого спектра биологически значимых процессов.
Детекция незаменимых аминокислот важна для их промышленного производства, особенно 8-ми аминокислот: валина, изолейцина, лейцина, метионина, треонина, триптофана, фенилаланина и лизина. Для высокопроизводительного скрининга штаммов-суперпродуцентов
аминокислот, необходимо проводить мониторинг таких аминокислот на клеточном уровне. Аминокислоты могут выполнять роль нейромедиаторов и нейро модуляторов в головном мозге, однако их роль остается малоизученной из-за отсутствия необходимых методов прижизненной детекции. Для решения этих задач необходимо разработать флуоресцентные генетически кодируемые аминокислотные индикаторы (ГКАИ).
До сих пор были получены ГКАИ на основе FRET (Фёрстеровского резонансного переноса энергии). Сенсоры FRET на основе флуоресцентных белков стали мощным инструментом для исследования белок-белковых взаимодействий и структурных изменений внутри белков. Но такие индикаторы имеют ограниченный флуоресцентный ответ на добавление аминокислот (меньше 100%) и требуют дорогостоящего оборудования, осложняя детекцию сигнала in vivo.Они содержат в своем составе два флуоресцентных белка, что существенно увеличивает их размер и ограничивает спектральный диапазон.
Все вышеупомянутое позволило выявить цель и задачи исследования.
Цель работы — разработка сенсора на изолейцин с оптимальным дизайном на основе одного яркого мономерного циркулярно- пермутированного белка mNeonGreen в качестве флуоресцентной части и изолейцин-валин-лейцин-связывающего белка LIVBP.
Для реализации поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Провести несколько раундов скрининга по увеличению контраста, яркости и специфичности.
2. Охарактеризовать свойства сенсора Nelle в растворе in vitro.
3. Охарактеризовать свойства сенсора Nelle в животных клетках.
Выпускная квалификационная работа написана на 67 листах , содержит 20 рисунков, 1 таблицу и список литературы, состоящий из 50 источников.
Детекция незаменимых аминокислот важна для их промышленного производства, особенно 8-ми аминокислот: валина, изолейцина, лейцина, метионина, треонина, триптофана, фенилаланина и лизина. Для высокопроизводительного скрининга штаммов-суперпродуцентов
аминокислот, необходимо проводить мониторинг таких аминокислот на клеточном уровне. Аминокислоты могут выполнять роль нейромедиаторов и нейро модуляторов в головном мозге, однако их роль остается малоизученной из-за отсутствия необходимых методов прижизненной детекции. Для решения этих задач необходимо разработать флуоресцентные генетически кодируемые аминокислотные индикаторы (ГКАИ).
До сих пор были получены ГКАИ на основе FRET (Фёрстеровского резонансного переноса энергии). Сенсоры FRET на основе флуоресцентных белков стали мощным инструментом для исследования белок-белковых взаимодействий и структурных изменений внутри белков. Но такие индикаторы имеют ограниченный флуоресцентный ответ на добавление аминокислот (меньше 100%) и требуют дорогостоящего оборудования, осложняя детекцию сигнала in vivo.Они содержат в своем составе два флуоресцентных белка, что существенно увеличивает их размер и ограничивает спектральный диапазон.
Все вышеупомянутое позволило выявить цель и задачи исследования.
Цель работы — разработка сенсора на изолейцин с оптимальным дизайном на основе одного яркого мономерного циркулярно- пермутированного белка mNeonGreen в качестве флуоресцентной части и изолейцин-валин-лейцин-связывающего белка LIVBP.
Для реализации поставленной цели сформулированы следующие задачи:
1. Провести несколько раундов скрининга по увеличению контраста, яркости и специфичности.
2. Охарактеризовать свойства сенсора Nelle в растворе in vitro.
3. Охарактеризовать свойства сенсора Nelle в животных клетках.
Выпускная квалификационная работа написана на 67 листах , содержит 20 рисунков, 1 таблицу и список литературы, состоящий из 50 источников.
✅ Заключение
Таким образом, в ходе выполнения магистерской диссертации разработан сенсор на изолейцин с оптимальным дизайном на основе одного яркого мономерного циркулярно-пермутированного белка mNeonGreen в качестве флуоресцентной части и изолейцин-валин-лейцин-связывающего белка LIVBP.
Исходя из полученных результатов, можно сделать следующие выводы:
1. Разработан генетически кодируемый интенсио метрический индикатор на изолейцин Nelle на основе одного зеленого флуоресцентного белка, который позволяет детектировать аминокислоту изолейцин, и с меньшей чувствительностью, лейцин и валин in vitro.
2. Спектральные свойства, молекулярная яркость, олигомерное состояние, период полусозревания, фототабильность сенсора охарактеризованы in vitroв растворе. Исходя из полученных данных, индикатор Nelle является мономерным и может быть использован для мечения белков в органеллах животных клеток.
3. Разработанный индикатор Nelle и его радиометрическая версия были успешно проэкспрессированы в различных органеллах животных клеток.
Таким образом, индикатор Nelle является первым мономерным генетически кодируемым зелёным флуоресцентным индикатором на основе одного флуоресцентного белка с высоким контрастом на изолейцин. Разработанный индикатор Nelle открывает возможность высокопродуктивного скрининга для создания бактериальных штаммов- суперпродуцентов незаменимой аминокислоты изолейцина и изучения роли изолейцина в качестве потенциального нейромедиатора или нейромодулятора в головном мозге.
Исходя из полученных результатов, можно сделать следующие выводы:
1. Разработан генетически кодируемый интенсио метрический индикатор на изолейцин Nelle на основе одного зеленого флуоресцентного белка, который позволяет детектировать аминокислоту изолейцин, и с меньшей чувствительностью, лейцин и валин in vitro.
2. Спектральные свойства, молекулярная яркость, олигомерное состояние, период полусозревания, фототабильность сенсора охарактеризованы in vitroв растворе. Исходя из полученных данных, индикатор Nelle является мономерным и может быть использован для мечения белков в органеллах животных клеток.
3. Разработанный индикатор Nelle и его радиометрическая версия были успешно проэкспрессированы в различных органеллах животных клеток.
Таким образом, индикатор Nelle является первым мономерным генетически кодируемым зелёным флуоресцентным индикатором на основе одного флуоресцентного белка с высоким контрастом на изолейцин. Разработанный индикатор Nelle открывает возможность высокопродуктивного скрининга для создания бактериальных штаммов- суперпродуцентов незаменимой аминокислоты изолейцина и изучения роли изолейцина в качестве потенциального нейромедиатора или нейромодулятора в головном мозге.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🖼 Скриншоты
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.