Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Использование метода HRM для анализа соматических мутаций при гемобластозах

Работа №164844

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

биология

Объем работы44
Год сдачи2020
Стоимость4290 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
22
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 6
1.1 Лейкозы 6
1.2 Острый миелоидный лейкоз 7
1.2.1 Генетическая основа развития острого миелоидного лейкоза 8
1.2.2 Мутации гена FLT3 10
1.2.3 Стратификация ОМЛ по группам прогноза 12
1.3 Миелопролиферативные неоплазмы 15
1.3.1 Строение сигнального пути JAK/STAT 15
1.3.2 Мутации генов сигнальных путей 18
1.3.3 Соматические мутации в гене кальретикулина (CALR) 20
1.4 Методы выявления мутаций в гене FLT3 22
1.5 Методы выявления мутаций в гене CALR 23
1.6 High Resolution Melt 24
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 28
2.1 Объект исследования 28
2.2 Выделение ДНК из клинического материала с использованием реагента
«ДНК-сорб-B» 28
2.3 Измерение концентрации ДНК 30
2.4 Проведение ПЦР-HRM с использованием комплекта реагентов Precision
Melt Supermix (Bio-Rad, США) 31
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 35
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 36
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 37


Лейкозы представляют собой широкую группу гемопоэтических злокачественных новообразований. В норме в костном мозге располагаются стволовые клетки крови, которые обладают способностью к дифференцировке и выполнению специализированных функций в организме. Из этих стволовых клеток развиваются все разновидности форменных элементов крови. При лейкозах кровяные клетки способны размножаться на более поздних стадиях гемопоэза, чем в норме, что приводит к замещению нормальных клеток костного мозга опухолевыми клетками.
Весь комплекс кроветворения можно разделить на два направления (ростка): лимфопоэз (образование лимфоцитов) и миелопоэз (образование остальных типов клеток крови). В зависимости от того, какой росток кроветворения поражен, лейкозы делятся на лимфоидные (лимфобластные) и миелоидные (миелобластные). По клиническому течению лейкозы делятся на острые и хронические [1,2].
Ассоциированные с лейкозами соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки. Поэтому на начальном этапе выполнения молекулярно-генетических диагностических процедур по выявлению мутаций желательно иметь возможность проведения в лаборатории скрининговых методов. Это особенно важно, когда проводится анализ редких и разнообразных мутаций, например, мутаций в гене FLT3 и CALR.
HRM-анализ позиционируется как быстрый, надежный и высокочувствительный метод для скрининга как однонуклеотидных замен, так и инсерций и делеций. Кроме того, он не требует больших временных затрат.
Исходя из вышесказанного, целью данной работы является скрининг соматических мутаций в генах FLT3 и CALR методом HRM-анализа при использовании амплификатора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США) для пациентов с диагнозом ОМЛ и Ph-МПН.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
4. Разработать тест-системы для выявления соматических мутаций в генах FLT3 и CALR на основе HRM-анализа.
5. Апробировать разработанные тест-системы на образцах ДНК от пациентов с диагнозом ОМЛ и Ph-МПН и ранее выявленными мутациями в генах FLT3 и CALR соответственно.
6. Сравнить полученные результаты с данными, полученными при использовании других молекулярно-генетических технологий

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

1. Разработаны тест-системы для выявления соматических мутаций в генах FLT3 и CALR на основе HRM-анализа.
2. Во всех проанализированных методом HRM-анализа образцах ДНК от пациентов с диагнозом ОМЛ и Ph-МПН выявлены соответствующие мутации в генах FLT3 и CALR.
3. Тип выявленных методом HRM-анализа мутаций во всех образцах совпал с мутациями, выявленными при использовании других молекулярно-генетических технологий.



1. Swerdlow, S. H. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms / S. H. Swerdlow, E. Campo, S. A. Pileri, [et al.] // Blood. - 2016. - Vol. 127, №. 20. - P. 2375-2390.
2. Arber, D. A. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia / D. A. Arber, A. Orazi, R. Hasserjian, [et al.] // Blood. - 2016. - Vol. 127, №. 20. - P. 2391-2405.
3. Bennett, J. M. Proposals for the classification of the acute leukaemias
French -AmMi COni-nBtrLtilSfi CFAVsky,-ope
M. T. Daniel, [et al.] // British journal of haematology. - 1976. - Vol. 33, №. 4. - P. 451-458.
4. Vardiman, J. W. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale andimportant changes / J. W. Vardiman, J. Thiele, D. A. Arber, [et al.] // Blood, The Journal of the American Society of Hematology. - 2009. - Vol. 114, №. 5. - P. 937¬951.
5. Schoch, C. Cytogenetics in acute myeloid leukemia / C. Schoch, T. Haferlach // Current oncology reports. - 2002. - Vol. 4, №. 5. - P. 390-397.
6. Rowley, J. D. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining / J. D. Rowley // Nature. - 1973. - Vol. 243, №. 5405. - P. 290-293.
7. Harrison, C. J. Cytogenetics of childhood acute myeloid leukemia: United Kingdom Medical Research Council Treatment trials AML 10 and 12 / C. J. Harrison, R. K. Hills, A. V. Moorman, [et al.] // Journal of clinical oncology. - 2010. - Vol. 28, №. 16. - P. 2674-2681.
8. Miyoshi, H. The t (8; 21) translocation in acute myeloid leukemia results
in production of an AML1 -ydTG8Tfu&ozutrKi.script
Shimizu, [et al.] // The EMBO journal. - 1993. - Vol. 12, №. 7. - P. 2715-2721.
9. Licht, J. D. Reconstructing a disease: What essential features of the retinoic acid receptor fusion oncoproteins generate acute promyelocytic leukemia? / J. D. Licht // Cancer cell. - 2006. - Vol. 9, №. 2. - P. 73-74
10. Meyer, C. The MLL recombinome of acute leukemias in 2013 / C. Meyer, J. Hofmann, T. Burmeister, [et al.] // Leukemia. - 2013. - Vol. 27, №. 11. - P. 2165¬2176.
11. Schnittger, S. Screening for MLL tandem duplication in 387 unselected patients with AML identify a prognostically unfavorable subset of AML / S. Schnittger, U. Kinkelin, C. Schoch, [et al.] // Leukemia. - 2000. - Vol. 14, №. 5. - P. 796-804.
12. Thiede, C. Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis / C. Thiede, C. Steudel, B. Mohr, [et al.] // Blood, The Journal of the American Society of Hematology. - 2002. - Vol. 99, №. 12. - P. 4326¬4335.
13. Falini, B. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias / B. Falini, I. Nicoletti, N. Bolli, [et al.] // Haematologica. - 2007. - Vol. 92, №. 4. - P. 519-532.
14. Grafone, T. An overview on the role of FLT3-tyrosine kinase receptor in acute myeloid leukemia: biology and treatment / T. Grafone, M. Palmisano, C. Nicci, [et al.] // Oncology reviews. - 2012. - Vol. 6, №. 1. - P. 64-74
15. Rosnet, O. Human FLT3/FLK2 receptor tyrosine kinase is expressed at the surface of normal and malignant hematopoietic cells / O. Rosnet, H. J. Buhring, S. Marchetto, [et al.] // Leukemia. - 1996. - Vol. 10, №. 2. - P. 238-248.
16. Бавыкин, А. С. Flts-тирозинкиназа при острых нелимфобластных лейкозах / А. С. Бавыкин, М. А. Волкова // Онкогематология. - 2006. - №. 1. - C. 15-24.
17. Whitman, S. P. Absence of the wild-type allele predicts poor prognosis in adult de novo acute myeloid leukemia with normal cytogenetics and the internal tandem duplication of FLT3: a cancer and leukemia group B study / S. P. Whitman, K.
J. Archer, L. Feng, [et al.] // Cancer research. - 2001. - Vol. 61, №. 19. - P. 7233¬7239.
18. Schnittger, S. Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia: correlation to cytogenetics, FAB subtype, and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease / S. Schnittger, C. Schoch, M. Dugas, [et al.] // Blood, The Journal of the American Society of Hematology. - 2002. - Vol. 100, №. 1. - P. 59-66.
19. Antar, A. Inhibition of FLT3 in AML: a focus on sorafenib / A. Antar, Z. K Otrock, J. El-Cheikh, [et al.] // Bone marrow transplantation. - 2017. - Vol. 52, №. 3. - P. 344-351.
20. Allen, C. The importance of relative mutant level for evaluating impact on outcome of KIT, FLT3 and CBL mutations in core-binding factor acute myeloid leukemia / C. Allen, R. K. Hills, K. Lamb, [et al.] // Leukemia. - 2013. - Vol. 27, №. 9. - P. 1891-1901.
21. Cornelissen, J. J. Results of a HOVON/SAKK donor versus no-donor analysis of myeloablative HLA-identical sibling stem cell transplantation in first remission acute myeloid leukemia in young and middle-aged adults: benefits for whom? / J. J. Cornelissen, W. L. J Van Putten, L. F Verdonck, [et al.] // Blood. - 2007. - Vol. 109, №. 9. - P. 3658-3666.
22. Kuhnl, A. Molecular markers in acute myeloid leukaemia / A. Kuhnl, D. Grimwade // International journal of hematology. - 2012. - Vol. 96, №. 2. - P. 153¬163.
23. Grimwade, D. Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials / D. Grimwade, R. K. Hills, A. V. Moorman, [et al.] // Blood, The Journal of the American Society of Hematology. - 2010. - Vol. 116, №. 3. - P. 354-365.
24. Breems, D. A. Monosomal karyotype in acute myeloid leukemia: a better indicator of poor prognosis than a complex karyotype / DA Breems, W. L. J Van Putten, G. E De Greef, [et al.] // Journal of Clinical Oncology. - 2008. - Vol. 26, №. 29. - P. 4791-4797.
25. Smith, M. L. Independent prognostic variables in acute myeloid leukaemia / M. L. Smith, R. K. Hills, D. Grimwade // Blood reviews. - 2011. - Vol. 25, №. 1. - P. 39-51.
26. Меликян, А. Л. Биология миелопролиферативных новообразований / А.Л. Меликян, И. Н. Суборцева // Клиническая онкогематология. - 2016. - Т. 9, №. 3. - С. 314-325
27. Naeim, F. Myeloproliferative Neoplasms Associated with JAK2, MPL, and CALR Mutations / F. Naeim, N. P. Rao, S. X. Song, [et al.] // Atlas of Hematopathology. -2018. - № 12. - P. 217-238.
28. Velazquez, L. A protein tyrosine kinase in the interferon a0 signaling pathway / L. Velazquez, M. Fellous, G. R. Stark, [et al.] // Cell. - 1992. - Vol. 70, №. 2. - P. 313-322.
29. Igaz, P. Biological and clinical significance of the JAK-STAT pathway; lessons from knockout mice / P. Igaz, S. Toth, A. Falus // Inflammation Research. - 2001. - Vol. 50, №. 9. - P. 435-441.
30. Hammaren, H. M. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease/H.M. Hammaren, A. T. Virtanen, J. Raivola, [et al.] // Cytokine.
- 2019. - Vol. 118. - P. 48-63.
31. Morita, Y. Signals transducers and activators of transcription (STAT)- induced STAT inhibitor-1 (SSI-1)/suppressor of cytokine signaling-1 (SOCS-1) suppresses tumor necrosis factor а-induced cell death in fibroblasts / Y. Morita, T. Naka, Y. Kawazoe, [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000.
- Vol. 97, №. 10. - P. 5405-5410.
32. Абдулкадыров, К. М. Миелопролиферативные новообразования / К. М. Абдулкадыров, В. А. Шуваев, И. С. Мартынкевич // Литтерра. - 2016. - Т. 304. - С. 171.
33. Baxter, E. J. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders / E. J. Baxter, L. M. Scott, P. J. Campbell, [et al.] // The Lancet. - 2005. - Vol. 365, №. 9464. - P. 1054-1061.
34. Scott, L. M. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis / L. M Scott, W. Tong, R. L. Levine, [et al.] // New England Journal of Medicine. - 2007. - Vol. 356, №. 5. - P. 459-468.
35. Pikman, Y. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia / Y. Pikman, B. H Lee, T. Mercher, [et al.] // PLoS medicine. - 2006. - Vol. 3, №. 7. - P. 1-12.
36. Ferreira Cristina, S. Somatic Mutations in Philadelphia Chromosome¬Negative Myeloproliferative Neoplasms / S. Ferreira Cristina, B. Polo, J. F. Lacerda // Seminars in Hematology. - 2018. Vol. 55, № 4. - P. 215-222
37. Staerk, J. The JAK-STAT pathway and hematopoietic stem cells from the JAK2 V617F perspective / J. Staerk, S. N. Constantinescu // Jak-Stat. - 2012. - Vol. 1, №. 3. - P. 184-190.
38. Skoda, R. Pathogenesis of myeloproliferative neoplasms / R. C. Skoda, A. Duek, J. Grisouard // Experimental hematology. - 2015. - Vol. 43, №. 8. - P. 599-608.
39. Абдулкадыров, К.М. Современные представления о диагностике и лечении эссенциальной тромбоцитемии / К.М. Абдулкадыров, В.А. Шуваев, И.С. Мартынкевич, [и др.] // Вестник гематологии. - 2014. - Т.10, №1. - С. 4-39.
40. Lu, Y. C. Functional roles of calreticulin in cancer biology / Y. C. Lu, W. C. Weng, H. Lee // BioMed research international. - 2015. - Vol. 2015. - P. 1-10.
41. Burns, K. Modulation of gene expression by calreticulin binding to the glucocorticoid receptor / K. Burns, B. Duggan, E. A. Atkinson. // Nature. - 1994. - P. 476-480.
42. Krause, K. H. Calreticulin / K. H. Krause, M. Michalak // Cell. -1997. - Vol. 88, №4. - P. 439-443.
43. Michalak, M. Calreticulin / M. Michalak, R. E. Milner, K. Burns, M. Opas // Biochemical Journal. -1992. - № 3. -P. 681- 692.
44. Klampfl, T. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferatie neoplasms / T. Klampfl, H. Gisslinger, A. S. Harutyunyan // The new England journal of medicine. -2013. -№ 369. - P. 2379-2389.
45. Pardanani, A. D. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients / A. D. Pardanani, R. L. Levine, T. Lasho, [et al.] // Blood. - 2006. - Vol.108, №10. - P. 3472-3476.
46. Arak,i M. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. / M. Araki, Y. Yang, N. Masubuchi, [et al.] // Blood. - 2016. - Vol.127, №10. - Р. 1307-1316.
47. Kiyoi, H. Internal tandem duplication of FLT3 associated with leukocytosis in acute promyelocytic leukemia / H. Kiyoi, T. Naoe, S. Yokota, [et al.] // Leukemia. - 1997. - Vol. 11, №. 9. - P. 1447-1452.
48. Kim, Y. Quantitative fragment analysis of FLT3-ITD efficiently identifying poor prognostic group with high mutant allele burden or long ITD length / Y. Kim, G. D Lee, J. Park, [et al.] // Blood cancer journal. - 2015. - Vol. 5, №. 8. - P. 1-7.
49. Beretta, C. Development of a quantitative-PCR method for specific FLT3/ITD monitoring in acute myeloid leukemia / C. Beretta, G. Gaipa, V. Rossi, [et al.] // Leukemia. - 2004. - Vol. 18, №. 8. - P. 1441-1444.
50. Abdelhamid, E. Minimal residual disease monitoring based on FLT3 internal tandem duplication in adult acute myeloid leukemia / E. Abdelhamid, C. Preudhomme, N. Helevaut, [et al.] // Leukemia research. - 2012. - Vol. 36, №. 3. - P. 316-323.
51. Kamps, R. Next-generation sequencing in oncology: genetic diagnosis, risk prediction and cancer classification / R. Kamps, R. D. Brandao, B. J. Bosch, [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2017. - Vol. 18, №. 2. - P. 1-57.
52. Jones, A. V. Evaluation of methods to detect CALR mutations in myeloproliferative neoplasms / A. V. Jones, D. Ward, M. Lyon, [et al.] // Leukemia research. - 2015. - Vol. 39, №. 1. - P. 82-87.
53. Mehrotra, M. Clinical validation of a multipurpose assay for detection and genotyping of CALR mutations in myeloproliferative neoplasms / M. Mehrotra, R. Luthra, R. R. Singh, [et al.] // American journal of clinical pathology. - 2015. - Vol. 144, №. 5. - P. 746-755.
54. Maier, C. L. Development and validation of CALR mutation testing for clinical diagnosis / C. L. Maier, K. E. Fisher, H. H. Jones, [et al.] // American journal of clinical pathology. - 2015. - Vol. 144, №. 5. - P. 738-745.
55. Bilbao-Sieyro, C. High resolution melting analysis: a rapid and accurate method to detect CALR mutations / C. Bilbao-Sieyro, G. Santana, M. Moreno, [et al.] // PloS one. - 2014. - Vol. 9, №. 7. - P. 1-5.
56. Chi, J. Calreticulin mutations in myeloproliferative neoplasms and new methodology for their detection and monitoring / J. Chi, M. Manoloukos, C. Pierides, [et al.] // Annals of hematology. - 2015. - Vol. 94, №. 3. - P. 399-408.
57. Luo, W. Calreticulin (CALR) mutation in myeloproliferative neoplasms (MPNs) / W. Luo, Z. Yu // Stem cell investigation. - 2015. - Vol. 2. - P. 1-10
58. White, H. Mutation scanning by high resolution melt analysis. Evaluation of Rotor- Gene 6000 (Corbett Life Science), HR-1 and 384 well Light Scanner (Idaho technology) / H. White, G. Potts // National Genetics Reference Laboratory. - 2013. - P.1-45.
59. Wittwer, C. High resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. / G. Reed, C. Gundry, J. Vandersteen, [et al.] // Clinical chemistry - 2003. - P. 853-860.
60. Rozovski, U. An accurate, simple prognostic model consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary myelofibrosis / U. Rozovski, S. Verstovsek, T. Manshouri, [et al.] // Haematologica. - 2017. - Vol. 102, № 1. - P. 79-84.
61. Tan, A. Y. C. Detection of NPM1 exon 12 mutations and FLT3-internal tandem duplications by high resolution melting analysis in normal karyotype acute myeloid leukemia / A. Y. C. Tan, D. A Westerman, D. A Carney, [et al.] // Journal of hematology & oncology. - 2008. - Vol. 1, №. 1. - P. 1-10.


Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.