ИССЛЕДОВАНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ГИПОХЛОРИТОМ ОКИСЛЕНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
|
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Система фибринолиза. Плазминоген, плазмин 7
1.2 Структура плазминогена 9
1.3 Крингл-домены плазминогена 11
1.4 Активаторы плазминогена 15
1.4 Фибриновая сеть, система свёртывания крови 17
1.5 Окислительный стресс 25
1.6 Методы выявления модификаций в белковых молекулах 30
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1 Материалы исследования 36
2.2 Методы исследования 36
2.2.1 Выделение плазминогена 36
2.2.2 Выделение фибриногена 37
2.2.3 Оценка гомогенности полученных препаратов белка 38
2.2.4 Проверка амидолитической активности 38
2.2.5 Проверка ферментативной активности плазмина 38
2.2.6 Окисление плазминогена гипохлоритом (HOCl) 38
2.2.7 Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС) 40
2.2.8 Инфракрасная спектроскопия 42
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ... 43
3.1 Результаты проверки активности плазминогена (электрофорез) 43
3.2 Результаты проверки методом электрофореза эффекта HOCl/OCl-на
плазминоген 44
3.3 Результаты проверки кинетическим анализом активности плазмина
при увеличении количества HOCl/OCl- 46
3.4 Результаты проверки методом ИК-спектроскопии влияния на
вторичную структуру белка окисление плазминогена 47
3.5 Результаты проверки методом масс-спектрометрии возникновения
модификаций при окислении плазминогена гипохлоритом 52
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 59
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 61
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Система фибринолиза. Плазминоген, плазмин 7
1.2 Структура плазминогена 9
1.3 Крингл-домены плазминогена 11
1.4 Активаторы плазминогена 15
1.4 Фибриновая сеть, система свёртывания крови 17
1.5 Окислительный стресс 25
1.6 Методы выявления модификаций в белковых молекулах 30
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1 Материалы исследования 36
2.2 Методы исследования 36
2.2.1 Выделение плазминогена 36
2.2.2 Выделение фибриногена 37
2.2.3 Оценка гомогенности полученных препаратов белка 38
2.2.4 Проверка амидолитической активности 38
2.2.5 Проверка ферментативной активности плазмина 38
2.2.6 Окисление плазминогена гипохлоритом (HOCl) 38
2.2.7 Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС) 40
2.2.8 Инфракрасная спектроскопия 42
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ... 43
3.1 Результаты проверки активности плазминогена (электрофорез) 43
3.2 Результаты проверки методом электрофореза эффекта HOCl/OCl-на
плазминоген 44
3.3 Результаты проверки кинетическим анализом активности плазмина
при увеличении количества HOCl/OCl- 46
3.4 Результаты проверки методом ИК-спектроскопии влияния на
вторичную структуру белка окисление плазминогена 47
3.5 Результаты проверки методом масс-спектрометрии возникновения
модификаций при окислении плазминогена гипохлоритом 52
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 59
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 61
Актуальность работы. Плазминоген играет значительную физиологическую и патологическую роль в ряде жизненно-важных процессов. Данный белок - предшественник плазмина, сериновой протеазы, основная функция которой - это осуществление внутрисосудистого тромболизиса, является недостаточно изученным белком плазмы крови в отношении его посттрансляционных окислительных модификаций и, как следствие, структурных нарушений.
Плазминоген является ключевым белком фибринолитической системы крови - важного защитного механизма предупреждения возникновения тромбозов. В основе деятельности фибринолитической системы находится реакция превращения плазминогена в активный фермент плазмин. Нарушение активации плазминогена приводит к угнетению фибринолиза и может привести к тромбозам, и как следствие к различным заболеваниям. Тромбоз — опасное состояние, которое может встречаться в том числе, как осложнение различных заболеваний [35].
В течение своей жизни организмы постоянно подвергаются воздействию систем, генерирующих активные формы кислорода, которые могут вызвать повреждения белков, нуклеиновых кислот и липидов. К ним относятся ряд факторов окружающей среды, таких как облучение (рентгеновские лучи, у-лучи, ультрафиолетовый свет), загрязняющие вещества в атмосфере (озон, N 2O 2 , NO 2, сигаретный дым); однако многие являются простыми побочными продуктами нормальных метаболических процессов, таких как автоокисление восстановленных форм электронных носителей (NAD (P) H, восстановленные флавины, цитохром P450s), воспалительные реакции, синтез оксида азота, катализируемые оксидазой реакции, реакции перекисного окисления липидов и реакции, катализируемые металлами (в том числе система Фентона). Окисление аминокислотного остатка, которое происходит в результате взаимодействия молекулы с АФК, может служить диагностическим признаком различных заболеваний, сопровождающимися повышенной генерацией свободных радикалов в организме.
Плазменные белки, которые защищены антиоксидантными ферментами в несопоставимо меньшей степени по сравнению с внутриклеточными белками, непрерывно подвергаются окислительным атакам со стороны нейтрофилов. Активация нейтрофилов как in vitro,так и in vivoпри определенных заболеваниях (например, при воспалительных процессах, атеросклерозе и др.) вызывает генерацию высоко реактивных АФК, таких как O2- и H2O2, и высвобождение фермента миелопероксидазы. Реакция последней с H2O2в присутствии физиологических концентраций Cl-приводит к образованию продукта HOCl/OCl-, который рассматривается одним из главных окислителей в плазме крови.
Целью работы является исследование особенности индуцированного гипохлоритом окисления молекулы плазминогена, влияние окисления на функцию фермента (плазмина) , проанализировать полученную информацию об обнаруженных окислительных модификациях и сопоставить их с функциональными нарушениями молекулы.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделить плазминоген и оценить его гомогенность и функции;
2. Провести картирование молекул исследуемых белков методом масс-спектрометрии высокого разрешения для определения окислительно модифицированных аминокислотных остатков;
3. Сопоставить локализации окислительных модификаций в аминокислотных остатках исследуемого белка с возможными функциональными и структурными нарушениями;
4. Оценить влияние физиологического окислителя - гипохлорита на молекулу плазминогена.
Выпускная квалификационная работа написана на 66 листах, содержит 20 рисунков, 2 таблицы и список литературы на русском и английском языках из 72 источников.
Плазминоген является ключевым белком фибринолитической системы крови - важного защитного механизма предупреждения возникновения тромбозов. В основе деятельности фибринолитической системы находится реакция превращения плазминогена в активный фермент плазмин. Нарушение активации плазминогена приводит к угнетению фибринолиза и может привести к тромбозам, и как следствие к различным заболеваниям. Тромбоз — опасное состояние, которое может встречаться в том числе, как осложнение различных заболеваний [35].
В течение своей жизни организмы постоянно подвергаются воздействию систем, генерирующих активные формы кислорода, которые могут вызвать повреждения белков, нуклеиновых кислот и липидов. К ним относятся ряд факторов окружающей среды, таких как облучение (рентгеновские лучи, у-лучи, ультрафиолетовый свет), загрязняющие вещества в атмосфере (озон, N 2O 2 , NO 2, сигаретный дым); однако многие являются простыми побочными продуктами нормальных метаболических процессов, таких как автоокисление восстановленных форм электронных носителей (NAD (P) H, восстановленные флавины, цитохром P450s), воспалительные реакции, синтез оксида азота, катализируемые оксидазой реакции, реакции перекисного окисления липидов и реакции, катализируемые металлами (в том числе система Фентона). Окисление аминокислотного остатка, которое происходит в результате взаимодействия молекулы с АФК, может служить диагностическим признаком различных заболеваний, сопровождающимися повышенной генерацией свободных радикалов в организме.
Плазменные белки, которые защищены антиоксидантными ферментами в несопоставимо меньшей степени по сравнению с внутриклеточными белками, непрерывно подвергаются окислительным атакам со стороны нейтрофилов. Активация нейтрофилов как in vitro,так и in vivoпри определенных заболеваниях (например, при воспалительных процессах, атеросклерозе и др.) вызывает генерацию высоко реактивных АФК, таких как O2- и H2O2, и высвобождение фермента миелопероксидазы. Реакция последней с H2O2в присутствии физиологических концентраций Cl-приводит к образованию продукта HOCl/OCl-, который рассматривается одним из главных окислителей в плазме крови.
Целью работы является исследование особенности индуцированного гипохлоритом окисления молекулы плазминогена, влияние окисления на функцию фермента (плазмина) , проанализировать полученную информацию об обнаруженных окислительных модификациях и сопоставить их с функциональными нарушениями молекулы.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Выделить плазминоген и оценить его гомогенность и функции;
2. Провести картирование молекул исследуемых белков методом масс-спектрометрии высокого разрешения для определения окислительно модифицированных аминокислотных остатков;
3. Сопоставить локализации окислительных модификаций в аминокислотных остатках исследуемого белка с возможными функциональными и структурными нарушениями;
4. Оценить влияние физиологического окислителя - гипохлорита на молекулу плазминогена.
Выпускная квалификационная работа написана на 66 листах, содержит 20 рисунков, 2 таблицы и список литературы на русском и английском языках из 72 источников.
В ходе выполнения бакалаврской работы было исследовано индуцированное гипохлоритом окисление плазминогена.
По результатам исследования можно сделать следующие выводы:
1. Выделен плазминоген и оценены его гомогенность и функции. Снижение протеолитической активности плазмина, полученного из окисленного плазминогена, подтверждается результатами фотометрии и электрофореза.
2. Произведено картирование молекул исследуемых белков методом масс-спектрометрии высокого разрешения и определенно окислительно модифицированные аминокислотные остатки. Показано, что 50 мкМ окислителя вовлекало в процесс окисления только крингл-домены KR-2, KR-4и сериновый, протеазный домен SP,в то время как при количестве окислителя 150 мкМ все структурные области плазминогена были окислены. Основная доля модифицированных остатков в плазминогене приходится на остатки метионинов и триптофанов.
3. Сопоставлены локализации окислительных модификаций в аминокислотных остатках исследуемого белка с возможными функциональными и структурными нарушениями. Данные ИК спектроскопии показывают, что под действием окислителя на Glu- плазминоген его вторичная структура подверглась перестройкам, отражающимся в снижении содержания а- и 310-helices, 0- turns, random coils на фоне существенного увеличения 0-sheets.
4. Показанно влияние физиологического окислителя - гипохлорита на молекулу плазминогена. Достаточно высокая толерантность плазминогена к окислению обусловлена как его закрытой конформацией, так и способностью некоторых из остатков метионинов служить ловушками АФК.
Совокупность полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что молекула плазминогена проявляет достаточно высокую толерантность к действию окислителя, что может быть обусловлено как его закрытой конформацией, делающей недоступными для окисления ключевые в функциональном отношении аминокислотные остатки, так и способностью некоторых из остатков метионинов служить ловушками АФК.
По результатам исследования можно сделать следующие выводы:
1. Выделен плазминоген и оценены его гомогенность и функции. Снижение протеолитической активности плазмина, полученного из окисленного плазминогена, подтверждается результатами фотометрии и электрофореза.
2. Произведено картирование молекул исследуемых белков методом масс-спектрометрии высокого разрешения и определенно окислительно модифицированные аминокислотные остатки. Показано, что 50 мкМ окислителя вовлекало в процесс окисления только крингл-домены KR-2, KR-4и сериновый, протеазный домен SP,в то время как при количестве окислителя 150 мкМ все структурные области плазминогена были окислены. Основная доля модифицированных остатков в плазминогене приходится на остатки метионинов и триптофанов.
3. Сопоставлены локализации окислительных модификаций в аминокислотных остатках исследуемого белка с возможными функциональными и структурными нарушениями. Данные ИК спектроскопии показывают, что под действием окислителя на Glu- плазминоген его вторичная структура подверглась перестройкам, отражающимся в снижении содержания а- и 310-helices, 0- turns, random coils на фоне существенного увеличения 0-sheets.
4. Показанно влияние физиологического окислителя - гипохлорита на молекулу плазминогена. Достаточно высокая толерантность плазминогена к окислению обусловлена как его закрытой конформацией, так и способностью некоторых из остатков метионинов служить ловушками АФК.
Совокупность полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что молекула плазминогена проявляет достаточно высокую толерантность к действию окислителя, что может быть обусловлено как его закрытой конформацией, делающей недоступными для окисления ключевые в функциональном отношении аминокислотные остатки, так и способностью некоторых из остатков метионинов служить ловушками АФК.