ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Усреднённый состав и происхождение пчелиного мёда 7
1.2 Изменение состава пчелиного мёда в процессе хранения 9
1.3 Биологическая активностью компонентов пчелиного мёда 11
1.3.1 Антиоксидантная и противовоспалительная активность 11
1.3.2 Антибактериальная и ранозаживляющая активность 13
1.4 Усреднённый состав и происхождение перги 14
1.5 Биологическая активностью компонентов перги 17
1.5.1 Антиоксидантная и противовоспалительная активность перги.... 18
1.5.2 Антибактериальная активность перги 19
1.6 Биологически активные пептиды и их роль в организме 19
1.6.1 Биологически активные пептиды пчёл, пчелиного мёда и перги. .20
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 23
2.1 Материалы исследования 23
2.2 Методы исследований 23
2.2.1 Ультрафильтрация 23
2.2.2 Ионообменная хроматография 25
2.2.3 Обращённофазная твердофазная экстракция 27
2.2.4 Обращённофазная высокоэффективная хроматография 28
2.2.5 Осаждение белков трихлоруксусной кислотой 30
2.2.6 Определение концентрации фруктозы реакцией Селиванова 30
2.2.7 Определение концентрации белка методом Лоури 31
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 32
3.1 Построение калибровочных прямых по белку и фруктозе 32
3.2 Ионообменная хроматография 33
3.2.1 Ход разделения и результаты 33
3.2.2 Ионообменная хроматография разбавленных растворов перги и
мёда 36
3.2.3 Катионообменная хроматография 38
3.3 Осаждение белков трихлоруксусной кислотой 40
3.4 Результаты твердофазной экстракции пептидов 42
3.5 Препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография... .46
3.6 Сравнение методов выделения и очистки пептидов 49
ВЫВОДЫ 51
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 52
Актуальность исследования. В настоящее время становится актуальной задача поиска новых групп терапевтических препаратов, обеспечивающих сильный терапевтический ответ при минимальных побочных явлениях и противопоказаниях. В связи с этим перспективным становится исследование различных веществ биологического происхождения, состав которых совершенствовался миллионами лет эволюции.
На фоне различных продуктов животного и растительного происхождения в качестве лекарственных средств в народной медицине выгодно выделяются продукты пчеловодства. Пчелиный мёд, маточное молочко, перга, трутневый расплод широко используются из-за своих полезных свойств, высокой питательной ценности [2, 55].
Прогресс в области биохимии и методов исследования биологической активности показал нам, что существует целый класс соединений, обладающих мощным регуляторным и стимулирующим потенциалом — биологически активные пептиды, поэтому сейчас актуальна задача поиска и характеристики новых пептидов, обладающих антимикробной, регуляторной или какой-либо ещё биологической активностью. Например, антимикробные пептиды видятся перспективной заменой антибиотикам, т. к. не вызывают антибиотикоустойчивости, в терапевтических концентрациях не оказывают токсического действия на системы организма, могут модулировать иммунный ответ [28].
Перспективными в отношении поиска новых биологически активных пептидов выглядят продукты пчеловодства — мёд и перга, издавна использовавшиеся в народной медицине как средства против многих заболеваний. За последние 50 лет было открыто, что мёд и перга имеют антибактериальное, противовоспалительное и антиоксидантное действие, обусловленное содержащимися в них различными веществами как растительного, так и пчелиного происхождения.
Выделение отдельных биологически активных пептидов пчелиного мёда и перги позволит не только охарактеризовать эти пептиды с фундаментальной точки зрения, но и потенциально позволит создать на их основе разнообразные препараты, обладающие антибактериальным, ранозаживляющим, иммуностимулирующим действием. Выделение и характеристика биологически активных пептидов из пчелиного мёда и перги послужит мощным толчком для развития изучения других пчелопродуктов — маточного молочка, трутневого расплода, обножки, подмора и т. д., тоже обладающих определённой биологической активностью [3, 14, 53, 61].
Разработка оптимального метода выделения и очистки пептидной фракции пчелиного мёда и перги для дальнейшего изучения их биологической активности совершенно необходима, т. к. пчелиный мёд и перга относятся к многокомпонентным системам, и изучение биологической активности отдельных фракций невозможна без сколько-нибудь приемлемой степени очистки исследуемых молекул. Недопустимо исследовать биологическую активность тех или иных пептидов в смеси с углеводами, фенольными соединениями, витаминами и другими компонентами мёда или перги, т. к. будет невозможно точно указать на то, благодаря какому компоненту наблюдается тот или иной биологический эффект. Например, анаболическое действие мёда может проявляться как вследствие регуляторного действия пептидов, входящих в его состав, так и вследствие большой концентрации углеводов, несущих чисто энергетическую функцию.
Цель работы: разработать оптимальный метод выделения и очистки пептидной фракции пчелиного мёда и перги для дальнейшего изучения биологической активности пептидов этих пчелопродуктов.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1. Провести анализ литературы по теме исследования.
2. Исследовать и выбрать оптимальный способ выделения и очистки пептидной фракции пчелиного мёда.
3. Исследовать и выбрать оптимальный способ выделения и очистки пептидной фракции перги.
4. Сравнить исследованные методы выделения и очистки пептидных фракций мёда и перги.
Магистерская диссертация написана на 60 листах, содержит 23 рисунка, 6 таблиц и список литературы на русском и английском языках из 81 источника.
В качестве выводов можно сказать, что:
1. Ни один из исследованных методов разделения биомолекул не показал свою эффективность при разделении сложных смесей — растворов мёда и перги.
2. Основное препятствие на пути к выделению изолированной и как можно полной пептидной фракции мёда и перги — высокая концентрация углеводов.
3. Выявлено, что мёд и перга содержат определённое количество пептидных соединений.
4. Не смотря на относительно высокое содержание пептидов в пчелином мёде и меньшее — в перге, основная задача стоит не в выделении этих пептидов, а в очистке их от примесей, в первую очередь углеводов.
