ВВЕДЕНИЕ 3
1 ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДА PINUS SYLVESTRIS L 6
1.1 Таксономическое положение P. sylvestris 6
1.2 Подвиды сосны обыкновенной 7
1.3 Морфология и распространение сосны обыкновенной 8
1.4 Экономическое значение и использование сосны обыкновенной 12
2 ДНК-МАРКЕРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ИССЛЕДОВАНИЯХ 14
2.1 Преимущества и основные классы ДНК-маркеров 14
2.1 Микросателлитные маркеры 16
2.3 Микросателлитные маркеры для рода Pinus L 18
2.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.3 Районы исследования ценопопуляций сосны обыкновенной
2.4 Разработка новых микросателлитных маркеров для сосны
обыкновенной
2.5 Отбор и отработка полиморфных микросателлитных локусов сосны
обыкновенной
2.6 Оценка показателей генетического разнообразия
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Отбор полиморфных маркеров
3.2 Оценка показателей внутри- и межпопуляционного генетического
разнообразия ценопопуляций P. sylvestris
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1 Обсуждение результатов разработки новых полиморфных ядерных
микросателлитных локусов для P. sylvestris Обсуждение полученных результатов для ценопопуляций P. sylvestris
ВЫВОДЫ 22
ПРИЛОЖЕНИЕ А Существующие микросателлитные локусы для P. sylvestris 31
ПРИЛОЖЕНИЕ Б Разработанные микросателлитные локусы для P. sylvestris
Сохранение генетического разнообразия основных лесообразующих пород России является острой проблемой современности. В результате стрессового воздействия природных и антропогенных факторов среды, количество особей вида, участвующих в образовании нового поколения сокращается и, следовательно, снижается генетическое разнообразие и устойчивость популяций. Только предварительно изучив популяционногенетическую структуру лесообразующего вида, можно успешно разрешить проблему сохранения его генетического разнообразия [1].
Одним из способов получения данных о генетической изменчивости являются ДНК-маркеры, позволяющие определить внутрипопуляционное аллельное и генное разнообразие, дифференциацию на различных иерархических уровнях, а также степень инбридинга [2].
Разновидностью ДНК-маркеров с повторяющимися
последовательностями являются микросателлиты. Данные генетические маркеры обладают рядом преимуществ: высоким уровнем полиморфизма, относительно равномерным распределением в геноме и широкой представленностью, наличием большого числа аллелей, кодоменантностью
[3] .
Работы по разработке микросателлитных маркеров для различных хвойных пород активно осуществлялись в последние несколько лет, например, разработаны SSR (Simple Sequence Repeat) маркёры для Taxus contorta Griff.
[4] , Taxus cuspidata Siebold & Zucc. [5], Larix sibirica Ledeb [6], Pinus sibirica Du Tour [7]. Высокополиморфные микросателлитные локусы, имеющие кодоминантное наследование часто используются для исследования полиморфизма в том числе и Pinus sylvesrtis L. [8].
Сосна обыкновенная является одной из основных лесообразующих пород России и сопредельных стран. Известно, что древесина сосны обыкновенной обладает хорошими физико-механическими свойствами, также она используется как источник живицы, из сосновых опилок делают гидролизный спирт и т.д. [9].
Группа антропогенных факторов оказывает значительное влияние на рост и развитие популяций сосны обыкновенной, это подтверждается многочисленными исследованиями: с увеличением доли антропогенной нагрузки количество иголок на побеге растения уменьшается, а также происходит уменьшение длины самого побега и длины игл. Изменение данных морфологических признаков влияет на жизнеспособность сосны обыкновенной и при достижении определенного предела может привести к гибели популяции [10-16]. Экологический стресс в условиях техногенеза значительно влияет на репродуктивные способности сосны обыкновенной, в частности способствует образованию пыльцы низкого качества и снижению семенной продуктивности [17].
Таким образом, высокое экономическое значение сосны обыкновенной и её подверженность негативным влияниям техногенных эмиссий демонстрирует потребность регулярных мониторинговых наблюдений популяций данной хвойной породы. Одним эффективных способов определения влияния промышленных выбросов на сосну обыкновенную является исследование генетического разнообразия и популяционногенетической структуры вида. Как было изложено выше высокополиморфные микросателлитные локусы могут использоваться для мониторинга состояния хвойных путём исследования полиморфизма. Можно резюмировать, что имеется объективная необходимость в разработке новых генетических маркеров, применимых к исследованиям популяционно-генетической структуры вида.
Большинство существующих микросателлитных маркеров для P. sylvestris являются локусами с динуклеотидными мотивами, генотипирование с помощью которых путем проведения гель-электрофореза крайне затруднительно [18, 19].
Целью данной работы является разработка новых микросателлитных маркёров с три-, тетра и пентануклеотидными мотивами для сосны обыкновенной на основе полногеномного de novo секвенирования...
- Разработаны 39 новых микросателлитных локусов для сосны обыкновенной с три-, тетра-, пентануклеотидными мотивами и размерами амплифицируемого продукта от 140 до 280 н.о.;
- В результате тестирования найденных микросателлитных маркеров было отобрано шесть пар праймеров, демонстрирующих наиболее стабильные интерпретируемые спектры, для проведения дальнейшего исследования;
- Произведена отработка выбранных маркеров на 30 образцах ценопопуляции Северо-Енисейская и 24 образцах ценопопуляции Кизирская сосны обыкновенной из Северо-Енисейского и Курагинского районов Красноярского края соответственно;
- Выявлено 34 аллельных вариантов при исследовании выборок сосны
обыкновенной. В целом значения основных показателей генетической изменчивости выборок свидетельствуют о сравнительно невысоком уровне генетического разнообразия (NA = 4,917; NE =2,906; HO=0,454, He=0,478) при сопоставлении с аналогичными показателями,
приведенными для P. sylvestris другими авторами. Сравнение выборок из разных ценопопуляций показало, что выборка из более южного района находится ближе к равновесному состоянию (F= -0,018±0,053), чем выборка из более северного района, которая имеет 7,7%-ый дефицит гетерозигот (F= 0,077±0,045). Анализ популяционной структуры P. sylvestris показал, что в изученных выборках наблюдается 3%-ный дефицит гетерозиготных генотипов относительно популяциии (FIS=0,030±0,023) и почти 5%-ный дефицит (FIT = 0,049±0,026) относительно вида. Коэффициент инбридинга популяции относительно вида в целом (FST), отражающий степень подразделенности ценопопуляций составляет в среднем 0,020±0,005.
