Реферат 2
ВВЕДЕНИЕ 5
1. Флуоресценция белков как метод исследования их структуры
(литературный обзор) 7
1.1 Структура белков 7
1.1.1 Первичная структура белка 8
1.1.2 Вторичная структура белка 9
1.1.3 Третичная структура белка 12
1.1.4 Четвертичная структура белка 13
1.2 Собственная флуоресценция белков 13
1.3 Денатурация белков 18
1.4 Однотриптофановые белки 19
1.4.1 Светляковая люцифераза 20
1.4.2 Рибонуклеаза 22
1.4.3 Сывороточный альбумин человека 24
1.5 Время-разрешенная флуоресценция. Метод TCSPC 25
2. Материалы и методы 27
2.1 Материалы и оборудование 27
2.2. Методика эксперимента 28
2.3 Обработка результатов 28
3. Результаты и обсуждение 31
3.1 Спектры белков в ходе денатурации мочевиной 31
3.2. Анализ кривых перехода 31
3.3. Анализ кривых перехода, полученных по спектрам время-разрешенной
флуоресценции и их сравнение для всех белков 31
3.4. Проведение молекулярной динамики и анализ микроокружения
триптофанового остатка 31
3.5. Сравнение стабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica и
Lampyris turkestanicus 31
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 32
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 34
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 35
Основой многочисленных методов флуоресцентной спектроскопии белков является чувствительность фотофизических характеристик триптофанового аминокислотного остатка к изменению физико-химических свойств его микроокружения. Однако, интерпретация результатов, получаемых время-разрешенными методами спектроскопии, зачастую осложнена тем фактом, что спады флуоресценции триптофана носят не моноэкспоненциальный характер, и механизмы формирования регистрируемых компонент времени жизни флуоресценции белков и их спектральных вкладов всё еще не установлены окончательно. [15] Данная проблема проявляется наиболее ярко для многотриптофановых белков, в то время как исследование спектроскопических характеристик белков с единственным триптофаном может пролить свет на базовые механизмы формирования флуоресцентного сигнала.
Стабильность белка обуславливают такие параметры как химический состав раствора, pH среды, температура и любое изменение этих параметров влияет на стабильность связей и структуру молекулы белка в целом. Собственная флуоресценция белковой глобулы является чувствительным параметром к любым конформационных изменениям в структуре [13].
Целью настоящей работы является анализ время-разрешенных характеристик флуоресценции однотриптофановых белков, различающихся первичной последовательностью и трехмерной структурой, сопоставить полученные характеристики с локализацией триптофанов в белковой глобуле, сравнить стабильности однотриптофановых белков и провести сравнение характеристик люциферазы светляков Luciola mingrelica с гомологичной люциферазой Lampyris turkestanicus...
В данной работе была изучена равновесная денатурация трех однотриптофановых белков: люциферазы светляков Luciola mingrelica, рибонуклеазы T1 из Aspergillus oryzae и сывороточного альбумина человека.
Исследование было направлено на анализ разрешенных во времени характеристик флуоресценции трех однотриптофановых белков различной структуры. В работе были построены спектры флуоресценции и на их основе построены зависимости от концентрации мочевины таких параметров как отношение интенсивностей (I320/I360) и центр тяжести спектра (GC), которые отражают переход белка в денатурированное состояние. Также были изучены разрешенные в времени характеристики флуоресценции всех белков, получены времена жизни флуоресценции, построены спектры, ассоциированные с временами жизни и определены их вклады для всех белков. Также определены зависимости параметров времен жизни т1 и т2 и изменение положения спектральных компонент, ассоциированных с определенными временами жизни, на основе которых проведено их сравнение для всех белков.
Помимо вышеперечисленного, для объяснения происхождения двух основных компонент времени жизни флуоресценции, проанализирована пространственная структура исследованных белков. Было проведено вычисление молекулярной динамики структуры люциферазы, рибонуклеазы и сывороточного альбумина человека в явном растворителе.
На основании полученных в работе результатов были сделаны выводы:
1. Денатурация люциферазы светляков и рибонуклеазы Ti сопровождается уменьшением компоненты времени жизни флуоресценции т1 (около 2,5 и 2,2 нс) и увеличением компоненты времени жизни т2 (около 6 и 3,9 нс); денатурация HSA сопровождается уменьшением обеих компонент времени жизни (7 и 2,3 нс).
2. По изменению таких параметров как центр тяжести и отношение интенсивностей спектров флуоресценции при стационарном возбуждении,
время жизни флуоресценции, центр тяжести спектров, ассоциированных с временем жизни, идентифицируется один структурный переход люциферазы светляков с серединой при 3,1-3,2 М, в то время как у рибонуклеазы и HSA по изменению компонент времени жизни регистрируются два разных перехода.
3. В окружении триптофанового остатка люциферазы присутствует тушитель - атом серы Cys393, что может быть причиной возрастания одного из времен жизни белка при денатурации. Вблизи триптофана рибонуклеазы присутствует только карбоксильная группа глутаминовой кислоты Glu58, которая может являться тушителем флуоресценции этого белка. Для триптофанового остатка HSA потенциальных тушителей не обнаружено.
4. Молекулярная динамика выявляет наличие у каждого белка только одного стабильного ротамера триптофана, а значит ротамерная гипотеза не может объяснять наличие двух времен жизни флуоресценции этих белков.
