Список сокращений 3
1. Введение 4
2.Обзор литературы 6
3. Материалы и методы 14
4. Результаты и их обсуждение 24
5. Выводы 33
6. Благодарность 34
7. Список литературы 35
Бесплодие — актуальная проблема современной биологии и медицины. Бесплодным считается брак, в котором отсутствует беременность в течение года регулярной половой жизни без применения контрацепции. По данным Всемирной организации здравоохранения частота бесплодия во многих странах, в том числе и в России, достигает 17% [1]. Причиной отсутствия беременности в 40% случаев является женский фактор, в 60% мужской фактор, и в 30-48% выделяют сочетанное бесплодие [2]. Вспомогательные репродуктивные технологии представляют собой методы лечения бесплодия, при применении которых отдельные или все этапы зачатия и раннего развития эмбрионов осуществляются вне материнского организма, в том числе с использованием донорских и/или криоконсервированных половых клеток и эмбрионов. Согласно отчету Российской ассоциации репродукции человека за 2021 год в России было проведено 149 000 циклов ЭКО, из них более 13,5% циклов с использованием криоконсервированного биоматериала [3].
Практика применения материала, подверженного криоконсервации, используется повсеместно, что приводит к созданию криобанков спермы, сохраняющие лучшие образцы. Криоконсервация биоматериала проводится с использованием специальных сред, в составе которых используются высокорастворимые малотоксичные вещества - криопротекторы. Криопротекторы способствуют сохранению клеток при медленной заморозке, защищая клетки от осмотического шока, нарушения целостности клеточной стенки и препятствуют кристаллизации молекул H2O внутри клетки. Однако влияние криопротекторов при криоконсервации и самого механизма медленной заморозки на эпигеном сперматозоидов не до конца изучены. Ранее изучалось влияние криоконсервации в промоторных областях импринтированных генов SNURF-SNRPN и UBE3A, PWS-ICR и AS-ICR в области хромосомы 15q11-q13. Воздействие криопротектора не оказывало существенного влияния на уровни АФК (активный формы кислорода) и фрагментацию ДНК сперматозоидов. Ни криоконсервация, ни воздействие криопротектора существенно не влияли на метилирование ДНК выбранных участков гена. Однако фрагментация ДНК спермотозоидов имела положительную корреляцию с метилированием ДНК AS-ICR [4]. На сегодняшний день проблема метилирования в мужских половых клетках изучена не в полном объеме.
Целью работы является оценка изменения профиля метилирования ДНК сперматозоидов человека после криоконсервации.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
1. Освоить методы характеризации, криоконсервации и разморозкиэякулята, метод бисульфитного секвенирования;
2. Создать и охарактеризовать коллекцию образцов эякулята с тератозооспермией;
3. Оценить качество ДНК сперматозоидов после криоконсервации;
4. Подобрать оптимальные условия для проведения амплификации дифференциально метилированнойобласти генаН19. Провести оценку метилирования исследуемых образцов и сравнить профили метилирования ДНК исследуемых образцов после криоконсервации.
На основании полученных результатов были сформулированы следующие выводы:
1) Освоены методы характеризации, криоконсервации и разморозкиэякулята, метод бисульфитного секвенирования;
2) Создана коллекция криозамороженных образцов сперматозоидов пациентов с тератозооспермией с 12 образцами от 6 пациентов, создана коллекция “контрольных” образцов сперматозоидов (2 образцов от 14 пациентов). Все образцы были охарактеризованы стандартным спермиологическим анализом.
3) Криоконсервация не влияет на качество ДНК: концентрация ДНК после криоконсервации - (232±32) нг/мкл, соотношение A260/A280 - 1,90±0,10, число целостности DIN - 9,5±0,4.
4) Подобраны оптимальные условия проведения амплификации дифференциально метилированнойобласти генаH19, содержащей максимальное число CpG сайтов. Пилотное сравнение профилей метилирования ДНК фрагмента промотора гена H19 не выявило отличие между нативным и криоконсервированным материалом.
