Реферат
ВВЕДЕНИЕ 5
1 Обзор литературы 7
1.1 ДНК 7
1.2 Генетическая система бактерий 8
1.3 Система рестрикции- модификации 10
1.4 Ген 16S рРНК 11
1.5 Выделение ДНК из бактерий 12
1.6 Полимеразная цепная реакция 14
1.7 Электрофорез ДНК 16
1.8 Рестриктный анализ ДНК 17
1.9 Полиморфизм ДНК 18
1.10 Методы изучения полиморфизма ДНК 21
2 Материалы и методы 25
2.1 Объекты 25
2.2 Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду 25
2.3 Методика выделение ДНК 26
2.4 Методика проведения ПЦР 28
2.5 Методика очистки ампликонов 29
2.6 Проведение реакции рестрикции 30
2.7 Методика проведения электрофореза 30
3 Результаты 33
3.1 Выделение ДНК из биомассы бактери 33
3.2 Получение ампликонов 8F-1492R гена 16S рРНК 35
3.3 Сравнение теоретических электрофореграмм ампликонов гена 16S рРНК после обработки различными рестриктазами с электрофореграммами
из нашей базы данных 36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 43
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 44
В ходе проведения биологических исследований с использованием бактерий необходимо определить принадлежность микроорганизмов к тем или иным биологическим родам и видам. Более ранние работы по принадлежности бактерий основывались на морфологических и физиологических признаках чистых культур [1]. В последнее время широкое применение находят методы определения и сравнения микроорганизмов, основанные на рестрикционном анализе амплифицированной рибосомальной ДНК (ARDRA) [2]. ARDRA является действенным инструментом для выявления мутаций и полиморфизма различных генов путем сочетания подходящих наборов праймеров и выбора подходящей рестриктазы [3].
Анализ разнообразия длин рестрикционных фрагментов ДНК является действенным инструментом картирования генома, локализации генов, ответственных за генетические заболевания, определения риска заболевания, получения генетических отпечатков и определения родства. Рестриктный анализ был успешно применен для ДНК-диагностики рака [4], болезни Альцгеймера [5] и муковисцидоза [6].
Цель работы:
Проанализировать ряд образцов бактерий рестрикцией их ампликонов гена 16S рРНК и определить их вид.
Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выделить ДНК из опытных образцов бактерий, определить концентрацию и чистоту полученных препаратов ДНК.
2. Получить ампликоны гена 16S рРНК для данных бактерий с использованием пары праймеров 8F и 1492R.
3. Провести реакции рестрикции для полученных ампликонов.
4. Провести горизонтальный гель-электрофорез полученных
рестриктов с маркерами в агарозном геле.
5. Обработать полученные электрофореграммы с помощью гель- документирующей системы и путем сравнения с электрофореграммами из нашей базы данных идентифицировать микроорганизмы.
Работа выполнена на кафедре Медицинской биологии в Институте Фундаментальной Биологии и Биотехнологии СФУ.
В ходе работы был проведен анализ ARDRA ампликонов 8F - 1492R гена 16S рРНК бактерий, высеянных мной на кафедре биотехнологии. Была выделена ДНК данных образцов бактерий, проведены амплификация и реакции рестрикции, данные были визуализированы с помощью электрофореза в агарозном геле. Путём сравнения теоретических электрофореграмм из нашей базы данных и полученных мною практических электрофореграмм были идентифицированы предоставленные образцы бактерий. Они оказались представителями видов Bacillus Pumilus, Bacillus Cereus, Achromobacter Xylosoxidans, Agrobacterium Tumefaciens, Arthrobacter globiformis, Pseudomonas fluorescens, Micrococcus luteus, Bacillus atrophaeus, Microbacterium phyllosphaerae, Exiguobacterium aurantiacum.
Наилучшим выбором набора рестриктаз для выявления вида бактерий с использованием рестриктного анализа ампликонов 8F-1492R оказались MspI, HaeIII, RsaI, HhaI, BstHHI.
