ВВЕДЕНИЕ 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Аффинная хроматография 6
1.2 Носители для аффинной хроматографии 9
1.3 Линкер 11
1.4 Лиганды и вспомогательные белки 12
1.4.1 Иммуноглобулины 12
1.4.2 Стрептавидин и авидин 16
1.4.3 Кальмодулин 19
1.4.4 S-белок 19
1.4.5 Глутатион 20
1.4.6 Полисахариды 20
1.4.7 Иммобилизованные ионы металлов и His-tag 21
1.4.8 Halo-tag 22
1.5 Удаление вспомогательных фрагментов 23
1.6 Биоспецифичные носители для биотехнологии 24
1.6.1 Частицы как носители для анализа 24
1.6.2 Частицы как носители для отбора специфичных ДНК аптамеров .. .30
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1 Вещества и реактивы 35
2.2 Выделение и очистка рекомбинантного стрептавидина 37
2.3 Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК, несущей ген
кБСЖК 38
2.4 Культивирование рекомбинантных клеток E. coli 38
2.5 Выделение и очистка рекомбинантного кБСЖК 38
2.6 Определение концентрации белков 39
2.7 Ковалентное присоединение стрептавидина и кБСЖК к магнитным
частицам 39
2.8 Определение количества ковалентно присоединенного к магнитным
частицам стрептавидина 41
2.9 Иммобилизация биотинилированного олигонуклеотида на стрептавидин -
активированных магнитных частицах 41
2.10 Выявление кБСЖК, ковалентно связанного с поверхностью магнитных частиц, с помощью конъюгата фотопротеина обелина с антителом к кБСЖК...42
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 43
3.1 Получение препарата рекомбинантного стрептавидина 43
3.2 Выделение и очистка рекомбинантного кБСЖК 44
3.3 Ковалентное присоединение стрептавидина к магнитным частицам 46
3.4 Ковалентное присоединение кБСЖК к магнитным частицам 49
3.5 Применение полученных активированных магнитных частиц как
биоспецифичных носителей 52
ВЫВОДЫ 55
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 56
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 58
Поверхностно-активированные сорбенты широко используются для аффинной хроматографии, а также в качестве биоспецифичных носителей для биотехнологии. Они подразделяются на неорганические, представленные в основном носителями на основе диоксида кремния, а также магнитными частицами, синтетическими органическими, например носители на основе полистирола, полиметакрилата, а также биополимерами, в основном представленными различными полисахаридами и их модификациями. Использование магнитных частиц в качестве носителя позволяет легко разделять реакционные смеси просто прикладывая внешнее магнитное поле, которое позволяет свободно отделить раствор от частиц с иммобилизованными на них веществами. Представленные на поверхности функциональные группы могут использоваться в неизменном виде или активироваться различными реагентами.
Благодаря высоко специфичному связыванию с помощью аффинных сорбентов выделяют целевые молекулы используя необработанный клеточный лизат, что значительно ускоряет процесс очистки целевого соединения. Также поверхностно-активированные сорбенты могут использоваться в качестве биоспецифичных носителей для биотехнологии. Например, разработаны методы отбора специфичных ДНК-аптамеров с использованием в качестве носителей магнитных микро- и наночастиц, а также различные методы анализа, например, анализ на аутоантитела и антитела к инфекционным агентам.
Целью работы являлось разработать способ получения магнитных микрочастиц, активированных белками интереса — рекомбинантными стрептавидином Streptomyces avidinii и кардиальным белком, связывающим жирные кислоты (кБСЖК), а также показать их использование в биотехнологии в качестве аффинных магнитных сорбентов и носителей.
Исходя из цели были сформулированы следующие задачи:
1. Получить высокоочищенные препараты рекомбинантных стрептавидина и кБСЖК;
2. Исследовать условия ковалентного связывания стрептавидина и кБСЖК с магнитными микрочастицами и синтезировать образцы, активированные соответствующими белками;
3. Изучить свойства полученных материалов как аффинных носителей для биотехнологии.
В ходе проведенных исследований были получены следующие результаты:
1. Получены высокоочищенные препараты рекомбинантных стрептавидина и кБСЖК в необходимых для исследования количествах.
2. Разработан способ химической иммобилизации рекомбинантных белков на поверхности магнитных аминированных микрочастиц.
3. Получены образцы биоспецифичных магнитных микрочастиц, на поверхности которых иммобилизован стрептавидин (с плотностью 0,97 ± 0,41 мкг/мг микрочастиц) и кБСЖК (с плотностью 0,2 ± 0,008 мкг/мг микрочастиц).
4. На примере биотинилированного производного модельного олигонуклеотида показано применение стрептавидин-активированных микрочастиц для эффективной иммобилизации биотин-содержащих молекул.
5. Показано использование кБСЖК-активированных микрочастиц как специфичных носителей для проведения in vitro селекции ДНК-аптамеров, аффинных к кБСЖК.
