Получение и изучение основных физико-химических свойств рекомбинантного варианта искусственной люциферазы NanoLuc как репортера для анализа in vitro
|
Введение 4
1 Обзор литературы 6
1.1 Люцифераза NanoLuc 6
1.1.1 Получение люциферазы NanoLuc 6
1.1.2 Физико-химические свойства NanoLuc 8
1.1.3 Устойчивость NanoLuc к модификациям 10
1.1.4 Применение в анализе in vitro 11
1.2 Методы модификации белков 14
1.2.1 Прямая химическая модификация белков 15
1.2.2 Модификации путем введения искусственных аминокислот 16
1.2.3 Ферментативное мечение белков 17
2 Материалы и методы 22
2.1 Оборудование 22
2.2 Материалы и реактивы 23
2.3 Приготовление компетентных клеток BL21(DE3) Codon plus (RIPL) ... 25
2.4 Получение генетических конструкций Pep-NanoLuc, NanoLuc-Pep,
NanoLuc(C164S)-Pep 25
2.5 Получение препаратов рекомбинантных люцифераз NanoL^ и ее
вариантов Pep-NanoLuc, NanoLuc-Pep, NanoLuc(C164S)-Pep 27
2.6 Измерение относительной биолюминесцентной активности люцифераз28
2.7 Определение спектра биолюминесценции NanoLuc 29
2.8 Изучение термостабильности NanoLuc 29
2.9 Определение температуры теплового перехода по собственной
триптофановой флуоресценции белка 29
2.10 Определение кинетических параметров биолюминесценции NanoLuc с
целентеразином и CBP 30
2.11 Химический синтез биотинилированных производных люцифераз .... 31
2.12 Модельный твердофазный биолюминесцентный микроанализ с
использованием в качестве меток биотинилированных производных люцифераз 31
2.13 Химическая модификация вариантов NanoLuc с олиготимидилатом NH2-
(dT)30 32
2.14 Модельный биолюминесцентный анализ с использованием в качестве
меток конъюгатов олиготимидилата с люциферазами 32
3 Результаты и обсуждение 34
3.1 Клонирование гена NanoLuc с гексапептидом LCTPSR 34
3.2 Получение препаратов рекомбинантной люциферазы NanoLuc и ее
вариантов 34
3.3 Основные физико-химические свойства NanoLuc 34
3.4 Относительная биолюминесцентная активность вариантов NanoLuc и их
стабильность при хранении 34
3.5 Получение биотинилированных производных люцифераз с помощью
химической модификации 34
3.6 Получение конъюгатов люциферазы с олигонуклеотидом NH2-(dT)30.. 34
3.7 Модельный биолюминесцентный анализ с использованием конъюгатов
олиготимидилата с люциферазами 34
Заключение 49
Список сокращений 51
Список использованной литературы 52
1 Обзор литературы 6
1.1 Люцифераза NanoLuc 6
1.1.1 Получение люциферазы NanoLuc 6
1.1.2 Физико-химические свойства NanoLuc 8
1.1.3 Устойчивость NanoLuc к модификациям 10
1.1.4 Применение в анализе in vitro 11
1.2 Методы модификации белков 14
1.2.1 Прямая химическая модификация белков 15
1.2.2 Модификации путем введения искусственных аминокислот 16
1.2.3 Ферментативное мечение белков 17
2 Материалы и методы 22
2.1 Оборудование 22
2.2 Материалы и реактивы 23
2.3 Приготовление компетентных клеток BL21(DE3) Codon plus (RIPL) ... 25
2.4 Получение генетических конструкций Pep-NanoLuc, NanoLuc-Pep,
NanoLuc(C164S)-Pep 25
2.5 Получение препаратов рекомбинантных люцифераз NanoL^ и ее
вариантов Pep-NanoLuc, NanoLuc-Pep, NanoLuc(C164S)-Pep 27
2.6 Измерение относительной биолюминесцентной активности люцифераз28
2.7 Определение спектра биолюминесценции NanoLuc 29
2.8 Изучение термостабильности NanoLuc 29
2.9 Определение температуры теплового перехода по собственной
триптофановой флуоресценции белка 29
2.10 Определение кинетических параметров биолюминесценции NanoLuc с
целентеразином и CBP 30
2.11 Химический синтез биотинилированных производных люцифераз .... 31
2.12 Модельный твердофазный биолюминесцентный микроанализ с
использованием в качестве меток биотинилированных производных люцифераз 31
2.13 Химическая модификация вариантов NanoLuc с олиготимидилатом NH2-
(dT)30 32
2.14 Модельный биолюминесцентный анализ с использованием в качестве
меток конъюгатов олиготимидилата с люциферазами 32
3 Результаты и обсуждение 34
3.1 Клонирование гена NanoLuc с гексапептидом LCTPSR 34
3.2 Получение препаратов рекомбинантной люциферазы NanoLuc и ее
вариантов 34
3.3 Основные физико-химические свойства NanoLuc 34
3.4 Относительная биолюминесцентная активность вариантов NanoLuc и их
стабильность при хранении 34
3.5 Получение биотинилированных производных люцифераз с помощью
химической модификации 34
3.6 Получение конъюгатов люциферазы с олигонуклеотидом NH2-(dT)30.. 34
3.7 Модельный биолюминесцентный анализ с использованием конъюгатов
олиготимидилата с люциферазами 34
Заключение 49
Список сокращений 51
Список использованной литературы 52
Целентеразин-зависимые люциферазы представляют собой небольшие одноцепочечные полипептиды массой 16-36 кДа. Их объединение в одну группу связано с тем, что они катализируют окисление одного и того же субстрата - целентеразина (CTZ) [1]. На данный момент были клонированы гены многих целентеразин-зависимых белков: люцифераз из мягкого коралла Renilla reniformis [2] и Renilla muelleri [3], фотопротеинов акворина [4] и обелина [5], люциферазы остракоды Cypridina (Vargula) hilgendorfii [6], копеподы Metridia longa [7] и другие.
Наряду с фундаментальным изучением целентеразин-зависимых систем большой интерес представляет их практическое применение. Так, они могут быть использованы в анализах, основанных на BRET-механизме, при in vivo визуализации, при изучении белок-белковых взаимодействий, в иммуноанализе и др. [8].
NanoLuc была искусственно создана американской корпорацией Promega. За ее основу взяли люциферазу глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris. Изначально полагали, что молекулярная масса этого белка составляла 109 кДа [9], однако впоследствии было выяснено, что в нативной конформации он представляет собой гетеротетрамер из двух субъединиц 19 кДа и двух - 35 кДа. [10] При этом биолюминесцентной активностью обладает только субъединица 19 кДа (Oluc-19), плохо экспрессируемая и нестабильная в отсутствие большей субъединицы.
Среди достоинств NanoLuc можно выделить увеличенную яркость, термостабильность, а также устойчивость к изменению pH. Основной недостаток связан с максимумом спектра (454 нм), сдвинутым в голубую область, что затрудняет применение в исследованиях in vivo. Другое ограничение - необходимость использования специфического субстрата, фуримазина, что повышает стоимость исследований [11].
Описанные ранее преимущества NanoLuc делают ее привлекательным объектом для применения в качестве биолюминесцентного репортера в анализе in vitro. Однако при использовании люцифераз в биолюминесцентном анализе возникает необходимость получения их конъюгатов с различными биоспецифичными молекулами. Как и другие целентеразин-зависимые люциферазы, NanoLuc теряет свою биолюминесцентную активность при конъюгировании. В связи с этим актуальным является исследование стабильности люциферазы при конъюгировании с биоспецифическими молекулами.
Целью настоящей работы являлось определить основные физикохимические свойства рекомбинантного варианта искусственной люциферазы NanoLuc и ее биоспецифичных производных как репортеров для анализа in vitro Достижение цели потребовало решения следующих задач:
1. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантной люциферазы NanoLuc
2. Исследовать физико-химические свойства полученного препарата: спектр биолюминесценции, термостабильность, температуру теплового перехода, а также параметры ферментативной кинетики
3. Получить варианты NanoLuc, удлиненной с амино- либо карбоксильного конца гексапептидом LCTPSR (Рер)
4. Определить относительную биолюминесцентную активность полученных вариантов NanoLuc и их устойчивость при хранении
5. Направленным химическим синтезом получить биоспецифичные производные вариантов NanoLuc (NanoLuc-биотин, NanoLuc-олиготимидилат) и определить их свойства как репортеров в анализе in vitro.
Наряду с фундаментальным изучением целентеразин-зависимых систем большой интерес представляет их практическое применение. Так, они могут быть использованы в анализах, основанных на BRET-механизме, при in vivo визуализации, при изучении белок-белковых взаимодействий, в иммуноанализе и др. [8].
NanoLuc была искусственно создана американской корпорацией Promega. За ее основу взяли люциферазу глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris. Изначально полагали, что молекулярная масса этого белка составляла 109 кДа [9], однако впоследствии было выяснено, что в нативной конформации он представляет собой гетеротетрамер из двух субъединиц 19 кДа и двух - 35 кДа. [10] При этом биолюминесцентной активностью обладает только субъединица 19 кДа (Oluc-19), плохо экспрессируемая и нестабильная в отсутствие большей субъединицы.
Среди достоинств NanoLuc можно выделить увеличенную яркость, термостабильность, а также устойчивость к изменению pH. Основной недостаток связан с максимумом спектра (454 нм), сдвинутым в голубую область, что затрудняет применение в исследованиях in vivo. Другое ограничение - необходимость использования специфического субстрата, фуримазина, что повышает стоимость исследований [11].
Описанные ранее преимущества NanoLuc делают ее привлекательным объектом для применения в качестве биолюминесцентного репортера в анализе in vitro. Однако при использовании люцифераз в биолюминесцентном анализе возникает необходимость получения их конъюгатов с различными биоспецифичными молекулами. Как и другие целентеразин-зависимые люциферазы, NanoLuc теряет свою биолюминесцентную активность при конъюгировании. В связи с этим актуальным является исследование стабильности люциферазы при конъюгировании с биоспецифическими молекулами.
Целью настоящей работы являлось определить основные физикохимические свойства рекомбинантного варианта искусственной люциферазы NanoLuc и ее биоспецифичных производных как репортеров для анализа in vitro Достижение цели потребовало решения следующих задач:
1. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантной люциферазы NanoLuc
2. Исследовать физико-химические свойства полученного препарата: спектр биолюминесценции, термостабильность, температуру теплового перехода, а также параметры ферментативной кинетики
3. Получить варианты NanoLuc, удлиненной с амино- либо карбоксильного конца гексапептидом LCTPSR (Рер)
4. Определить относительную биолюминесцентную активность полученных вариантов NanoLuc и их устойчивость при хранении
5. Направленным химическим синтезом получить биоспецифичные производные вариантов NanoLuc (NanoLuc-биотин, NanoLuc-олиготимидилат) и определить их свойства как репортеров в анализе in vitro.
NanoLuc - уникальная люцифераза, обладающая высокой биолюминесцентной активностью, малым размером, устойчивостью в широком диапазоне температур и pH. При использовании NanoLuc в качестве биолюминесцентного репортера возникает необходимость ее конъюгирования с биоспецифичными молекулами, что может привести к значительному изменению физико-химических характеристик люциферазы.
Несмотря на то, что SH группа 164-го остатка цистеина NanoLuc дикого типа доступна для конъюгирования с молекулами биотина, конъюгирование с крупными молекулами (олигонуклеотидом) проходит неэффективно, что свидетельствует о низкой доступности группы. Введение SH-группы на карбоксильный конец люциферазы в составе гексапептида при одновременной замене C164S значительно улучшает выход конъюгатов при реакции с олигонуклеотидом и сохраняет ее исходную активность.
На основе полученных результатов были сформулированы следующие выводы:
1. Получен препарат рекомбинантной люциферазы NanoLuc высокой очистки и изучены его основные физико-химические свойства (спектральные характеристики биолюминесценции, термостабильность, параметры ферментативной кинетики с разными типами субстрата).
2. Установлено, что NanoLuc катализирует окисление «свободного» целентеразина и целентеразина, в комплексе с Са2+-зависимым целентеразин- связывающим белком (СВР) с близкой эффективностью: kcat/Km = 7,9-106 и 5,4-106 М-1с-1, для целентеразина и CBP соответственно.
3. Генетическим фьюзингом получены варианты NanoLuc, удлиненные c амино либо карбоксильного конца олигопептидом LCTPSR (Рер), а также вариант гибрида с уникальным цистеиновым остатком.
4. Показано, что удлинение NanoLuc с амино конца приводит к существенному падению биолюминесцентой активности. Активность гибрида с уникальным цистеиновым остатком NanoLuc(C164S)-Pep составляет 98% от биолюминесцентной активности исходной NanoLuc.
5. Направленным химическим синтезом с высоким выходом получены высокоактивные конъюгаты NanoLuc(d64S)-Pep с биотином и
олиготимидилатом dT30. Твердофазным микроанализом показано, что полученные производные обладают как биолюминесценцией, близкой к таковой исходной NanoLuc, так и специфичным сродством к стрептавидину и олигоаденилату, соответственно.
Несмотря на то, что SH группа 164-го остатка цистеина NanoLuc дикого типа доступна для конъюгирования с молекулами биотина, конъюгирование с крупными молекулами (олигонуклеотидом) проходит неэффективно, что свидетельствует о низкой доступности группы. Введение SH-группы на карбоксильный конец люциферазы в составе гексапептида при одновременной замене C164S значительно улучшает выход конъюгатов при реакции с олигонуклеотидом и сохраняет ее исходную активность.
На основе полученных результатов были сформулированы следующие выводы:
1. Получен препарат рекомбинантной люциферазы NanoLuc высокой очистки и изучены его основные физико-химические свойства (спектральные характеристики биолюминесценции, термостабильность, параметры ферментативной кинетики с разными типами субстрата).
2. Установлено, что NanoLuc катализирует окисление «свободного» целентеразина и целентеразина, в комплексе с Са2+-зависимым целентеразин- связывающим белком (СВР) с близкой эффективностью: kcat/Km = 7,9-106 и 5,4-106 М-1с-1, для целентеразина и CBP соответственно.
3. Генетическим фьюзингом получены варианты NanoLuc, удлиненные c амино либо карбоксильного конца олигопептидом LCTPSR (Рер), а также вариант гибрида с уникальным цистеиновым остатком.
4. Показано, что удлинение NanoLuc с амино конца приводит к существенному падению биолюминесцентой активности. Активность гибрида с уникальным цистеиновым остатком NanoLuc(C164S)-Pep составляет 98% от биолюминесцентной активности исходной NanoLuc.
5. Направленным химическим синтезом с высоким выходом получены высокоактивные конъюгаты NanoLuc(d64S)-Pep с биотином и
олиготимидилатом dT30. Твердофазным микроанализом показано, что полученные производные обладают как биолюминесценцией, близкой к таковой исходной NanoLuc, так и специфичным сродством к стрептавидину и олигоаденилату, соответственно.
Подобные работы
- Получение и изучение основных физико-химических свойств
рекомбинантного варианта искусственной люциферазы NanoLuc
как репортера для анализа in vitro
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4800 р. Год сдачи: 2022 - Получение и изучение свойств гибридного белка, включающего одноцепочечное миниантитело 14D5a и целентеразин-зависимую люциферазу
NanoLuc
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4750 р. Год сдачи: 2022