Поиск генетических предикторов резистентности к антитромбоцитарным препаратам у пациентов с ИБС
|
Аннотация 2
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 8
1.1 Ишемическая болезнь сердца 8
1.1.1 Антитромбоцитарная терапия при ИБС 9
1.1.1.1 Ацетилсалициловая кислота 9
1.1.1.2 Клопидогрел 10
1.1.1.3 Резистенстность к антитромбоцитарным препаратам 12
1.2 Возможные генетические предикторы сердечно-сосудистых осложнений 14
1.2.1 Р-селектин 14
1.2.1.1 Полиморфизмы в генах Р-селектина и его лиганда 17
1.1.2 Рецептор фибриногена GPIIb-IIIa 20
1.2.3 Рецептор коллагена GPIa-IIa 22
1.2.4 Рецептор фактора Виллебранда GPIb-V-IX 23
1.2.5 Тромбоцитарный АДФ-рецептор P2Y12 24
1.2.6 Цитохром Р450, изофермент CYP2C19*2 25
1.2.7 Экспрессия Р-селектина 27
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31
2.1 Объект исследования 31
2.2 Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови с использованием реагента
«ДНК-экспресс-кровь» (НПФ Литех) 33
2.3 Выделение ДНК из клинического материала набором «ДНК-сорб-В»
(ООО ИнтерЛабСервис) 34
2.4 Выделение тромбоцитов из цельной крови 36
2.5 Выделение РНК из тромбоцитов с использованием реагента «Рибо-преп»
(ООО ИнтерЛабСервис) 37
2.6 Измерение концентрации РНК с использованием набора реагентов Quant-
iT™ ssRNA AssayKit (Invitrogen) 38
2.7 Оценка качества выделенной РНК 39
2.8 Проведение ПЦР с детекцией результата в режиме реального времени ... 41
2.8.1 Проведение аллель-специфичной ПЦР с использованием комплекта реагентов для амплификации «ПЦР-Комплект» (Синтол) с детекцией результатов в режиме реального времени 41
2.8.2 Проведение ПЦР с использованием комплекта реагентов «SNP-
ЭКПРЕСС-РВ» (НПФ Литех) с детекцией результата в режиме реального времени на приборе CFX96 (Bio-Rad) 43
2.8.3 Проведение ПЦР с использованием комплекта реагентов для амплификации «SNP-ЭКСПРЕСС» с электрофоретической детекцией
продуктов амплификции (НПФ Литех)45 2.8.4 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального
времени (ООО БИОЛАБМИКС) 46
2.9 Расчет относительного уровня экспрессии мРНК SELP 48
2.10 Разделение продуктов амплификации методом горизонтального
электрофореза 49
2.11 Статистическая обработка данных 50
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ55
ВВЕДЕНИЕ 5
1 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 8
1.1 Ишемическая болезнь сердца 8
1.1.1 Антитромбоцитарная терапия при ИБС 9
1.1.1.1 Ацетилсалициловая кислота 9
1.1.1.2 Клопидогрел 10
1.1.1.3 Резистенстность к антитромбоцитарным препаратам 12
1.2 Возможные генетические предикторы сердечно-сосудистых осложнений 14
1.2.1 Р-селектин 14
1.2.1.1 Полиморфизмы в генах Р-селектина и его лиганда 17
1.1.2 Рецептор фибриногена GPIIb-IIIa 20
1.2.3 Рецептор коллагена GPIa-IIa 22
1.2.4 Рецептор фактора Виллебранда GPIb-V-IX 23
1.2.5 Тромбоцитарный АДФ-рецептор P2Y12 24
1.2.6 Цитохром Р450, изофермент CYP2C19*2 25
1.2.7 Экспрессия Р-селектина 27
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31
2.1 Объект исследования 31
2.2 Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови с использованием реагента
«ДНК-экспресс-кровь» (НПФ Литех) 33
2.3 Выделение ДНК из клинического материала набором «ДНК-сорб-В»
(ООО ИнтерЛабСервис) 34
2.4 Выделение тромбоцитов из цельной крови 36
2.5 Выделение РНК из тромбоцитов с использованием реагента «Рибо-преп»
(ООО ИнтерЛабСервис) 37
2.6 Измерение концентрации РНК с использованием набора реагентов Quant-
iT™ ssRNA AssayKit (Invitrogen) 38
2.7 Оценка качества выделенной РНК 39
2.8 Проведение ПЦР с детекцией результата в режиме реального времени ... 41
2.8.1 Проведение аллель-специфичной ПЦР с использованием комплекта реагентов для амплификации «ПЦР-Комплект» (Синтол) с детекцией результатов в режиме реального времени 41
2.8.2 Проведение ПЦР с использованием комплекта реагентов «SNP-
ЭКПРЕСС-РВ» (НПФ Литех) с детекцией результата в режиме реального времени на приборе CFX96 (Bio-Rad) 43
2.8.3 Проведение ПЦР с использованием комплекта реагентов для амплификации «SNP-ЭКСПРЕСС» с электрофоретической детекцией
продуктов амплификции (НПФ Литех)45 2.8.4 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального
времени (ООО БИОЛАБМИКС) 46
2.9 Расчет относительного уровня экспрессии мРНК SELP 48
2.10 Разделение продуктов амплификации методом горизонтального
электрофореза 49
2.11 Статистическая обработка данных 50
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 53
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ55
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является главной причиной инвалидизации и смертности населения всех развитых стран. Согласно статистическим данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в Российской Федерации (РФ) имеет место значительное превышение показателей смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ИБС.
Основными причинами развития ИБС являются атеросклероз, спазм коронарных артерий, которые вызывают сужение просвета коронарных сосудов, приводя к недостаточному питанию кислородом кардиомиоцитов. Кроме того, среди причин возникновения заболевания могут быть нарушения обмена липопротеидов, изменения агрегационных свойств крови, генетические нарушения. В настоящее время все чаще обсуждает роль тромбоцитов как инициирующих агентов в развитии ИБС. Активация тромбоцитов - ключевой момент, определяющий выраженность нарушений кровоснабжения органов и тканей.
Важную роль в лечении ИБС играет приём антитромботических средств. Наиболее часто применяемый препарат - ацетилсалициловая кислота (АСК). Сообщается, что АСК недостаточно подавляет агрегацию тромбоцитов в каждом четвертом случае, то есть имеется высокая распространённость «аспиринорезистентности». На резистентность к АСК могут влиять клинические, клеточные и генетические факторы.
Развивающийся на фоне атеросклероза повышенный уровень воспаления может способствовать неполноценному ответу кровяных пластинок на действие АСК у пациентов с ИБС, что уменьшает эффективность лечения и повышает риск развития неблагоприятных событий. В связи с этим все чаще обсуждаются полиморфизмы в гене Р-селектина, потому как Р-селектин может способствовать развитию ИБС, повышенного воспалительного ответа, что в конечном итоге может привести к развитию резистентности к АСК. Молекула Р-селектина относится к группе молекул межклеточной адгезии. Он хранится в а-гранулах тромбоцитов и экспрессируется на их поверхности после стимуляции соответствующими агонистами. Его роль заключается в поддержании начального роллинга лейкоцитов и тромбоцитов на эндотелии. Помимо этого, он опосредует адгезию лейкоцитов к активированному эндотелию в процессе острого воспаления. Считается, что полиморфизмы в гене Р-селектина могут приводить к развитию ИБС, инсультов и ранних инфарктов миокарда. А повышенную экспрессию мРНК Р-селектина связывают с высоким риском развития тромбоза и атеросклероза.
На развитие резистентности к антитромбоцитарным препаратам могут влиять и полиморфизмы в генах тромбоцитарных рецепторов, которые играют роль в процессах адгезии, активации и агрегации тромбоцитов. К таковым генам относят: ген АДФ-рецептора тромбоцитов P2RY12, ген рецептора к коллагену ITGA2, ген рецептора к фибриногену ITGB3, ген тромбоцитарного рецептора фактора Виллебранда GP1BA и ген цитохрома Р450 CYP2C19*2. Однако однозначного мнения о четкой ассоциации генетических полиморфизмов и резистентности к антиагрегантам в настоящий момент нет.
Таким образом, цель работы - поиск генетических предикторов резистентности к антитромбоцитарным препаратам у пациентов с ИБС.
Исходя из поставленной цели, были выделены следующие задачи:
1. Провести анализ на наличие полиморфизмов в генах SELP и его лиганда SELPLG, в генах тромбоцитарных рецепторов и цитохрома Р450 у пациентов с ИБС.
2. Изучить ассоциацию генетических полиморфизмов с развитием ИБС и с резистентностью к АСК и клопидогрелу у пациентов с ИБС.
3. Провести анализ экспрессии мРНК гена Р-селектина у пациентов с ИБС и контрольной группы, а также у пациентов с ИБС до АКШ и через 7 дней после операции.
4. Оценить уровень экспрессии мРНК гена Р-селектина в зависимости от наличия изучаемых полиморфизмов.
Работа проведена на базе Научно-практической лаборатории
молекулярно-генетических методов исследований СФУ.
...
Основными причинами развития ИБС являются атеросклероз, спазм коронарных артерий, которые вызывают сужение просвета коронарных сосудов, приводя к недостаточному питанию кислородом кардиомиоцитов. Кроме того, среди причин возникновения заболевания могут быть нарушения обмена липопротеидов, изменения агрегационных свойств крови, генетические нарушения. В настоящее время все чаще обсуждает роль тромбоцитов как инициирующих агентов в развитии ИБС. Активация тромбоцитов - ключевой момент, определяющий выраженность нарушений кровоснабжения органов и тканей.
Важную роль в лечении ИБС играет приём антитромботических средств. Наиболее часто применяемый препарат - ацетилсалициловая кислота (АСК). Сообщается, что АСК недостаточно подавляет агрегацию тромбоцитов в каждом четвертом случае, то есть имеется высокая распространённость «аспиринорезистентности». На резистентность к АСК могут влиять клинические, клеточные и генетические факторы.
Развивающийся на фоне атеросклероза повышенный уровень воспаления может способствовать неполноценному ответу кровяных пластинок на действие АСК у пациентов с ИБС, что уменьшает эффективность лечения и повышает риск развития неблагоприятных событий. В связи с этим все чаще обсуждаются полиморфизмы в гене Р-селектина, потому как Р-селектин может способствовать развитию ИБС, повышенного воспалительного ответа, что в конечном итоге может привести к развитию резистентности к АСК. Молекула Р-селектина относится к группе молекул межклеточной адгезии. Он хранится в а-гранулах тромбоцитов и экспрессируется на их поверхности после стимуляции соответствующими агонистами. Его роль заключается в поддержании начального роллинга лейкоцитов и тромбоцитов на эндотелии. Помимо этого, он опосредует адгезию лейкоцитов к активированному эндотелию в процессе острого воспаления. Считается, что полиморфизмы в гене Р-селектина могут приводить к развитию ИБС, инсультов и ранних инфарктов миокарда. А повышенную экспрессию мРНК Р-селектина связывают с высоким риском развития тромбоза и атеросклероза.
На развитие резистентности к антитромбоцитарным препаратам могут влиять и полиморфизмы в генах тромбоцитарных рецепторов, которые играют роль в процессах адгезии, активации и агрегации тромбоцитов. К таковым генам относят: ген АДФ-рецептора тромбоцитов P2RY12, ген рецептора к коллагену ITGA2, ген рецептора к фибриногену ITGB3, ген тромбоцитарного рецептора фактора Виллебранда GP1BA и ген цитохрома Р450 CYP2C19*2. Однако однозначного мнения о четкой ассоциации генетических полиморфизмов и резистентности к антиагрегантам в настоящий момент нет.
Таким образом, цель работы - поиск генетических предикторов резистентности к антитромбоцитарным препаратам у пациентов с ИБС.
Исходя из поставленной цели, были выделены следующие задачи:
1. Провести анализ на наличие полиморфизмов в генах SELP и его лиганда SELPLG, в генах тромбоцитарных рецепторов и цитохрома Р450 у пациентов с ИБС.
2. Изучить ассоциацию генетических полиморфизмов с развитием ИБС и с резистентностью к АСК и клопидогрелу у пациентов с ИБС.
3. Провести анализ экспрессии мРНК гена Р-селектина у пациентов с ИБС и контрольной группы, а также у пациентов с ИБС до АКШ и через 7 дней после операции.
4. Оценить уровень экспрессии мРНК гена Р-селектина в зависимости от наличия изучаемых полиморфизмов.
Работа проведена на базе Научно-практической лаборатории
молекулярно-генетических методов исследований СФУ.
...
Исходя из проделанной работы, можно выделить основные выводы:
1. Статистически значимых отличий по распространенности полиморфизмов rs6136, rs6133, rs6136 в гене SELP, rs2228315 в гене SELPLG, rs1126643, rs5819, rs6065, rs4244285 и rs2046934 в генах ITGA2, ITGB3, GP1BA, CYP2C19*2 и P2RY12 между группой пациентов с диагнозом ИБС и группой доноров не выявлено.
2. Носительство минорных аллелей полиморфизмов rs6136, rs6133, rs6136 в гене SELP, rs2228315 в гене SELPLG, rs1126643, rs5819, rs6065, rs4244285 и rs2046934 в генах ITGA2, ITGB3, GP1BA, CYP2C19*2 и P2RY12 не ассоциировано с проявлением резистенстности к антитромбоцитарным препаратам.
3. При сравнении АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов среди носителей распространенной и минорной аллелей полиморфизма rs6131 гена SELP были выявлены достоверные отличия (р=0,01).
4. При сравнении относительного уровня экспрессии мРНК SELP между группой пациентов с ИБС и группой доноров были выявлены статистически значимые отличия (p=0,048). Прием антиагрегантных средств подавляет экспрессию Р-селектина. Значимых отличий уровня экспрессии мРНК SELP среди групп пациентов до АКШ и после АКШ не обнаружено. Однако наблюдалось повышение уровня экспрессии у каждого пациента после операции по сравнению с соответствующим показателем до АКШ.
5. При сравнении уровня экспрессии гена SELP у носителей минорной аллели и носителей мажорной аллели полиморфизмов rs6131, rs6133, rs6136 в этом же гене в группе пациентов до АКШ статистически значимых отличий не обнаружено. Уровень экспрессии мРНК гена SELP не зависит от данных полиморфизмов.
1. Статистически значимых отличий по распространенности полиморфизмов rs6136, rs6133, rs6136 в гене SELP, rs2228315 в гене SELPLG, rs1126643, rs5819, rs6065, rs4244285 и rs2046934 в генах ITGA2, ITGB3, GP1BA, CYP2C19*2 и P2RY12 между группой пациентов с диагнозом ИБС и группой доноров не выявлено.
2. Носительство минорных аллелей полиморфизмов rs6136, rs6133, rs6136 в гене SELP, rs2228315 в гене SELPLG, rs1126643, rs5819, rs6065, rs4244285 и rs2046934 в генах ITGA2, ITGB3, GP1BA, CYP2C19*2 и P2RY12 не ассоциировано с проявлением резистенстности к антитромбоцитарным препаратам.
3. При сравнении АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов среди носителей распространенной и минорной аллелей полиморфизма rs6131 гена SELP были выявлены достоверные отличия (р=0,01).
4. При сравнении относительного уровня экспрессии мРНК SELP между группой пациентов с ИБС и группой доноров были выявлены статистически значимые отличия (p=0,048). Прием антиагрегантных средств подавляет экспрессию Р-селектина. Значимых отличий уровня экспрессии мРНК SELP среди групп пациентов до АКШ и после АКШ не обнаружено. Однако наблюдалось повышение уровня экспрессии у каждого пациента после операции по сравнению с соответствующим показателем до АКШ.
5. При сравнении уровня экспрессии гена SELP у носителей минорной аллели и носителей мажорной аллели полиморфизмов rs6131, rs6133, rs6136 в этом же гене в группе пациентов до АКШ статистически значимых отличий не обнаружено. Уровень экспрессии мРНК гена SELP не зависит от данных полиморфизмов.
