Гибридные (химерные или слитые) белки представляют собой искусственные белки, полученные путем слияния нескольких ДНК, кодирующих «родительские» белки или олигопептиды в одной рамке считывания - т.е. подряд, без промежуточных стоп-кодонов. Эта ДНК экспрессируется в клетках-хозяевах (обычно в микробах), и полученный белок одновременно проявляет свойства «родительских» белков или олигопептидов.
Гибридный белок, у которого один из доменов обладает способностью специфично связываться с молекулой-мишенью, а другой является ферментом с визуально-регистрируемым продуктом (репортером), конструируют для применения в качестве специфичной метки в молекулярном анализе. Показано, что в качестве эффективного репортера можно использовать ферменты — люциферазы, одним из продуктов которых является свет.
NanoLuc представляет собой искусственную целентеразин-зависимую люциферазу с массой 19,1 кДа, созданную американской компанией Promega на основе люциферазы из глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris [1]. Биолюминесценция NanoLuc при использовании нового синтетического аналога целентеразина — фуримазина, существенно ярче, чем биолюминесценция люциферазы светлячка или мягкого коралла Renilla, что обеспечивает превосходную чувствительность анализа с использованием NanoLuc в качестве репортера. Будучи небольшим по размеру, этот белок хорош для экспериментов, требующих небольшого репортера (например, вирусных геномов). Кроме того, характеристики свечения и другие физикохимические свойства NanoLuc делают его идеальным репортером для анализа времени жизни белка и внутриклеточной стабильности. Превосходная яркость биолюминесценции и нетоксичность такой системы позволяют проводить видеоанализ транслокации белков в живых клетках с использованием биолюминесцентной визуализации. В совокупности особенности NanoLuc делают его универсальным репортером для анализа регуляции транскрипции или динамики внутриклеточных белков.
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является возбудителем одной из самых тяжелых нейроинфекций человека и животных. Клещевой энцефалит — природно-очаговая вирусная инфекция, характеризующаяся интоксикацией, лихорадкой и поражением серого вещества головного мозга и/или оболочек головного и спинного мозга (менингит и менингоэнцефалит). Заболевание может привести к стойким неврологическим и психиатрическим осложнениям и даже к смерти больного. Люди и животные заражаются энцефалитом через укусы зараженных этим вирусом иксодовых клещей. Вирус клещевого энцефалита может быть обнаружен в крови, начиная с первой фазы заболевания. Лабораторный диагноз обычно основывается на обнаружении специфических IgM либо в крови, либо в спинномозговой жидкости, которые выявляются во второй фазе. Важной рекомендацией является выявление ВКЭ в клещах после укуса с целью своевременной диагностики и терапии заболевания. Такое выявление проводят в лаборатории с помощью иммуноанализа экстракта клещей, либо анализа на основе ПЦР.
Ранее в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН была показана перспективность проведения такого анализа с использованием в качестве метки гибридного белка, состоящего из высокоспецифичного мышиного миниантитела к ВКЭ (14D5a) и целентеразин-зависимой люциферазы Renilla reniformis (Rm7).
Целью настоящей работы является получение гибридного белка, включающего миниантитело к ВКЭ и люциферазу NanoLuc (14D5a-NanoLuc), экспрессией соответствующего гена в рекомбинантных клетках штамма E. coli и изучение его свойств как перспективной, более чувствительной биолюминесцентной метки для выявления ВКЭ в гомогенном варианте анализа.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Получить и проанализировать генетическую конструкцию, кодирующую целевой гибрид 14D5a-NanoLuc.
2. Синтезировать целевой гибридный белок в рекомбинантных клетках E. coli, несущих плазмиду с геном целевого гибридного белка.
3. Получить препарат белка 14D5a-NanoLuc высокой очистки и изучить его основные биолюминесцентные свойства.
4. Получить рекомбинантный вариант белка-домена D3 гликопротеина E ВКЭ для использования в качестве модельной мишени в иммуноанализе.
5. Исследовать 14D5a-NanoLuc как биоспецифичный репортер в модельном твердофазном иммуноанализе.
Дипломная работа посвящена получению и определению свойств гибридного белка 14D5a-NanoLuc. Исходя из поставленных задач, были получены следующие результаты:
1. Получена генетическая конструкция, кодирующая гибридный белок 14D5a-NanoLuc и рекомбинантные клетки E. coli Rosetta Gami 2, несущие плазмиду pFLAG-14D5a-NanoLuc.
2. Целевой гибридный белок выделен из биомассы рекомбинантных клеток и очищен с помощью металл-аффинной хроматографии. По данным гель- электрофореза чистота белка составила 95,4%.
3. Исследованы биолюминесцентные свойства гибридного белка в сравнении с таковыми рекомбинантной люциферазы NanoLuc дикого типа. Установлены кинетические параметры реакции целевого гибридного белка с субстратом - целентеразином: Km = 0,347 цМ; Vmax = 1,9-105 о.с.е.-с-1; kcat = 1,9-105 с-1; kcat/Km = 5-105 pM-1T-1. Эффективность биолюминесцентной реакции гибридного белка ниже таковой NanoLuc дикого типа на порядок (k„t/Km = 7,9-106 pM^C1).
4. Исследована способность полученного белка связывать гликопротеин Е ВКЭ. Установлена зависимость биолюминесцентного сигнала от концентрации гликопротеина Е в диапазоне концентраций от 50 до 1000 нг/мл.
Таким образом, полученный нами гибридный белок обладает двумя функциями - биолюминесцентной активностью домена люциферазы NanoLuc и способностью миниантитела 14D5a связывать гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита - и может быть использован как специфичный репортер для выявления этого вируса.
