Введение 4
1. Обзор литературы 6
1.1 Клеточные технологии в тканевой инженерии 6
1.2 Биополимеры в качестве носителя культивируемых клеток 8
1.3 ПГА в качестве клеточных носителей 12
2 Материалы и методы 18
2.1 Объекты исследования 18
2.2 Методы исследования 19
2.2.1 Изготовление клеточных матриксов 19
2.2.2 Исследование поверхностных характеристик 19
2.2.3 Исследование физико-механических свойств 21
2.2.4 Культивирование клеток на матриксах из ИГА 21
2.2.5 Оценка жизнеспособности фибробластов 22
2.2.6 Окрашивание флуоресцентным красителем DAPI 23
2.2.7 Статистический анализ данных 24
3. Результаты 25
3.1 Характеристика полученных клеточных матриксов из ИГА 25
3.2 Свойства поверхностей изделий из ПГА 26
3.3 Физико-механические свойства клеточных матриксов из ПГА 29
3.4 Исследование жизнеспособности фибробластов на клеточных матриксах 30
3.5 Окрашивание флуоресцентными красителями 32
Выводы 34
Список литературы: 35
Тканевая инженерия, является одним из основных путей развития регенеративной медицины, целью которой является разработка биологических заменителей, путем объединения клеток с каркасным материалом, для восстановления, замены или регенерации дефектных тканей. Для создания клеточных каркасов используют биоматериалы. Такие материалы должны быть биоразлагаемыми и биосовместимыми, для того чтобы минимизировать реакции хозяина, включая воспаление. Одним из главных показателей биосовместимости является способность поверхности клеточных матриксов поддерживать адгезию и рост клеток, что в дальнейшем оказывает влияние на пролиферацию клеток [1]. Среди активно исследуемых биополимеров: полилактидов, полигликолидов, природных полимеров (хитозан, коллаген и др.), полигидроксиалканоаты (ПГА) занимают особое место. ПГА используют в качестве материалов медицинского назначения, в качестве систем доставки лекарств, имплантатов и сосудистых эндопротезов. В многочисленных публикациях доказано, что матриксы из ПГА облегчают пролиферацию клеток, таких как: остеобласты, хондроциты, фибробласты, нейроны и стволовые клетки [2]. Матриксы на основе ПГА благоприятно влияют на адгезию фибробластов и кератиноцитов в отличие от полилактидных подложек [3],[4].
В зависимости от размера алкильной группы ПГА разделяют на коротко, средне- и длинноцепочечные. К наиболее распространенным и изученным короткоцепочечным полимерам относят: гомополимер поли(3- гидроксибутирата) П3ГБ и его сополимеры с различным включением 3- гидроксивалерата П3ГБ/3ГВ или 4-гидроксибутирата П3ГБ/4ГБ; к среднецепочечным - сополимеры с различным включением 3- гидроксигексаноата П3ГБ/3ГГ. Разнообразие состава данного класса полимеров позволяет оценить как их структура и свойства (кристалличность, механическая прочность, температурные характеристики, скорости биораспада) могут повлиять на рост и адгезию культивируемых клеток.
В связи с вышеописанным цель данной работы способность клеточных матриксов на основе ПГА разного химического состава поддерживать рост и адгезию мышиных фибробластов линии NIH 3T3
При выполнении данной работы были поставлены следующие задачи:
1. Методом литья полимерного раствора с последующим испарением растворителя получить пленочные матриксы из ПГА разного химического состава
2. Исследовать свойства поверхности (краевой угол, топологию и морфологию) и физико-механические характеристики полученных пленок на основе ПГА
3. Исследовать способность клеточных матриксов на основе ПГА поддерживать рост и адгезию мышиных фибробластов линии NIH 3T3
1. Получены и исследованы клеточные матриксы в виде пленок на основе ПГА разного химического состава: П3ГБ, П3ГБ/3ГВ с включением 3- гидроксивалерата 13% и 23%, П3ГБ/3ГГ с включением 3-гидроксигексаноата 14%, П3ГБ/4ГБ с включением 4-гидроксибутирата 10% и 23%.
2. Доказано, что полученные пленки ПГА в зависимости от химического состава обладают различной структурой поверхности. Включение мономеров 3ГВ и 4ГБ приводит к снижению краевого угла смачивания (66,05 ± 3,14° и 68,55 ± 1,51°) пленок и повышению шероховатости (360 и 363 нм), в отличие от более гладких и гидрофобных пленок П3ГБ и П3ГБ/3ГГ. По данным физико-механических испытаний установлено, что сополимерные пленки на основе П3ГБ/4ГБ обладают эластичными свойствами, что подтверждено значениями удлинения при разрыве (10 - 11%) в отличие от прочных пленок на основе П3ГБ, П3ГБ/3ГВ, П3ГБ/3ГГ.
3. Доказано, что свойства поверхности клеточных матриксов влияют на адгезию и рост фибробластов мыши линии NIH 3T3, а именно при снижении краевого угла и уменьшении шероховатости до значений 249 и 281 нм наблюдается наибольший рост клеток, что подтверждается данными МТТ-теста и флуоресцентной микроскопии. Максимальное количество клеток зафиксировано на пленках П3ГБ/3ГВ с включением 3ГВ 23% и П3ГБ/4ГБ с включением 4ГБ 23%.
