Изучение влияния мутаций в гене UPF1 на жизнеспособность дрожжей Saccharomyces cerevisiae, несущих мутации в генах SUP35 и SUP45

2. Введение 5
3. Обзор литературы 7
3.1. Эукариотические факторы терминации трансляции 7
3.2. Эффективность терминации трансляции и влияющие на нее факторы 8
3.3. Система деградации нонсенс-содержащих мРНК (NMD) 9
3.4. Белок Upfl и его взаимодействие с факторами терминации трансляции 13
3.4.1. Структура белка Upfl 13
3.4.2. Взаимодействие Upf1 с факторами терминации трансляции 14
4. Материалы и методы 18
4.1. Штаммы 18
4.2. Плазмиды 19
4.3. Праймеры 22
4.4. Среды и условия культивирования 24
4.4.1. Среды и условия культивирования бактерий 24
4.4.2. Среды и условия культивирования дрожжей 24
4.5. Генетические и микробиологические методы 25
4.5.1. Бактериальная трансформация компетентных клеток 25
4.5.2. Трансформация дрожжей 25
4.5.3. Дрожжевой двугибридный анализ 25
4.6. Методы работы с ДНК 26
4.6.1. Выделение плазмидной ДНК 26
4.6.2. Рестрикция 27
4.6.3. Выделение дрожжевой ДНК 27
4.6.4. Очистка дрожжевой ДНК фенолом и хлороформом 27
4.6.5. ПЦР и электрофорез ДНК в агарозном геле 28
4.6.6. Секвенирование 29
4.6.7. Программое обеспечение 29
5. Результаты и обсуждение 30
5.1. Оценка жизнеспособности дрожжевых штаммов с нонсенс-мутациями в гене SUP45 на фоне делеции гена UPF1 по сравнению со штаммом без делеции 30
5.2. Анализ взаимодействия белков Sup35 и Sup45 c различными доменами белка
Upf1 32
5.3. Получение плазмид, содержащих точковые мутации гена UPF1, приводящих к
аминокислотным заменам продукта гена: C72S, C84S, C125S, K436E, RR793AA 36
5.4. Получение штаммов U-1A-D1628-uk.1 и U-14-D1690-uk.3 с мутациями гена
UPF1 на хромосоме 38
5.5. Оценка жизнеспособности штаммов, содержащих точковые мутации по гену
UPF1 на фоне нонсенс-мутации sup45-105 43
6. Обсуждение 46
7. Выводы 48
8. Список литературы 49
9. Благодарности 55

Купить

Терминация трансляции является заключительным этапом биосинтеза белка и в этом процессе основную роль у эукариот играют факторы eRF1 и eRF3, которые кодируются у дрожжей генами SUP45 и SUP35. eRF1 распознает стоп-кодон на мРНК, а eRF3, обладая ГТФ-азной активностью, участвует в освобождении полипептидной цепи от тРНК на рибосоме. Взаимодействие между eRF1 и eRF3 играет ключевую роль в эффективной терминации трансляции и последующем рибосомном рециклинге для подготовки к новому раунду синтеза белка (см. Hellen 2018).
Нонсенс-мутация — это тип мутации, при которой в результате изменения одного нуклеотида в гене возникает преждевременный стоп-кодон (PTC - premature termination codon), что приводит к досрочному прекращению синтеза белка во время трансляции. Это приводит к образованию неполноценного, укороченного белка, который может быть токсичен для клетки что может оказать влияние на функционирование организма и привести к различным генетическим заболеваниям человека. Показано, что 11% из всех мутаций, которые вызывают генетические заболевания у человека, являются нонсенс мутациями (Mort et al. 2008). Например, нонсенс-мутации могут быть причиной ряда наследственных заболеваний, таких как кистозный фиброз, мускулярная дистрофия и другие (Hirawat et al. 2007; Huang et al. 2019; Nagel-Wolfrum et al. 2016; Welch et al. 2007; Liu et al. 2020).
Однако существует явление нонсенс-супрессии — при которой преждевременный стоп-кодон в мРНК прочитывается как значащий, что позволяет клетке синтезировать полноразмерный белок, несмотря на нонсенс-мутацию в гене (Jeffrey H. Miller and A. Albertini, 1983). Нонсенс-супрессия возникает за счет нескольких механизмов, одним из которых является наличие мутаций в генах факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3. Такие мутации приводят к снижению эффективности терминации трансляции и прочтению стоп-кодона как значащего за счет присутствия в клетке естественных супрессорных тРНК.
С другой стороны, в клетке существует несколько систем контроля качества мРНК, одной из которых является система NMD (nonsense-mediated mRNA decay - Нонсенс-опосредованный распад мРНК) — это механизм, который обеспечивает распад дефектных мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны. В процессе NMD, мРНК с преждевременными стоп-кодонами распознаются и разрушаются, что предотвращает синтез дефектных белков. Этот механизм важен для поддержания качества трансляции и предотвращения накопления дефектных белков в клетке. Существуют разные модели, описывающие механизм этой системы деградации главную роль в этом процессе, играет комплекс белков Upf1-3.
Мутации в гене UPF1, которые приводят к нарушению функции продукта этого гена, усиливают нонсенс-супрессию, (Weng et al. 1996). Такие мутации, в частности, приводят к заменам в цистеин-гистидин-богатом домене белка Upf1 (CH-домен), который в свою очередь является РНК-связывающим доменом; и в геликазном домене.
В нашей лаборатории получены нонсенс-мутанты по генам SUP35 и SUP45 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Такие мутации приводят к снижению жизнеспособности штамма, однако не являются летальными поскольку в таких клетках, несмотря на наличие нонсенс-мутации в одном из генов факторов терминации трансляции, присутствует небольшое количество полноразмерного белка Sup35 или Sup45 (те. очевидно, происходит нонсенс-супрессия таких мутаций). При этом у многих нонсенс мутантов по гену SUP45 и SUP35 наблюдается амплификация гена с нонсенс-мутацией, дисомия района хромосомы, содержащей sup35-n или sup45- n, что в итоге приводит к повышению частоты транскрипции этого гена. Вероятно, такие изменения являются адаптацией, помогающей клеткам синтезировать небольшое количество полноразмерных белков Sup35 и Sup45 за счет супрессии нонсенс-мутации (Maksiutenko et al., 2021). Однако окончательно механизмы, обеспечивающие жизнеспособность мутантов по генам sup45-n, sup35-n не ясны.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что делеция гена UPF1 приводит к повышению жизнеспособности нонсенс- и миссенс-мутантов по гену SUP35 или SUP45 (Журавлева и Грызина, 2012). Однако, не известен механизм повышения жизнеспособности таких мутантов при нарушении работы системы NMD. В работе Weng с соавторами показано, что делеция любого участка гена UPF1 приводит к потере функциональности его продукта (Weng et al. 1996). В нашей работе мы использовали мутационный анализ для выявления участков белка Upf1, связанных с жизнеспособностью нонсенс мутантов гена SUP35 и SUP45.
Купить