Помощь студентам в учебе
АКТИВНОЕ ДЕМЕТИЛИРОВАНИЕ И НАРУШЕНИЕ ЦЕЛОСТНОСТИ ДНК В СПЕРМАТОЗОИДАХ ПАЦИЕНТОВ С НОРМО- И ПАТОЗООСПЕРМИЕЙ
|
ВВЕДЕНИЕ 4
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Основные этапы сперматогенеза человека 6
1.2. Особенности эпигенома клеток сперматогенного ряда 9
1.3. Причины и механизмы нарушения целостности ДНК сперматозоидов 14
1.4. РНК в клетках сперматогенного ряда и её функции 19
Глава 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 22
2.1. Материал 22
2.2. Методы 22
2.2.1. Метод фракционирования эякулята 22
2.2.2. Метод приготовления цитологических препаратов сперматозоидов из эякулята человека. 22
2.2.3 Анализ содержания сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов методом TUNEL 23
2.2.4. Анализ содержания сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК в эякуляте пациентов 23
2.2.5. Анализ препаратов и статистическая обработка данных 24
2.2.6. Метод выделения РНК из эякулята и последующий анализ уровня содержания РНК. 24
2.2.7. Метод постановки ПЦР в реальном времени. 26
2.3. Схема проведения эксперимента 27
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 28
3.1. Оценка содержания сперматозоидов с фрагментированной и гидроксиметилированной ДНК в разных фракциях эякулята 28
3.2. Оценка уровня содержания тотальной РНК, а также ТЕТ кодирующих РНК в разных фракциях эякулята пациентов 37
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42
ВЫВОДЫ 43
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 44
ПРИЛОЖЕНИЕ 50
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Основные этапы сперматогенеза человека 6
1.2. Особенности эпигенома клеток сперматогенного ряда 9
1.3. Причины и механизмы нарушения целостности ДНК сперматозоидов 14
1.4. РНК в клетках сперматогенного ряда и её функции 19
Глава 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 22
2.1. Материал 22
2.2. Методы 22
2.2.1. Метод фракционирования эякулята 22
2.2.2. Метод приготовления цитологических препаратов сперматозоидов из эякулята человека. 22
2.2.3 Анализ содержания сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов методом TUNEL 23
2.2.4. Анализ содержания сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК в эякуляте пациентов 23
2.2.5. Анализ препаратов и статистическая обработка данных 24
2.2.6. Метод выделения РНК из эякулята и последующий анализ уровня содержания РНК. 24
2.2.7. Метод постановки ПЦР в реальном времени. 26
2.3. Схема проведения эксперимента 27
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 28
3.1. Оценка содержания сперматозоидов с фрагментированной и гидроксиметилированной ДНК в разных фракциях эякулята 28
3.2. Оценка уровня содержания тотальной РНК, а также ТЕТ кодирующих РНК в разных фракциях эякулята пациентов 37
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 42
ВЫВОДЫ 43
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 44
ПРИЛОЖЕНИЕ 50
Бесплодие с каждым годом становится все более актуальной медико-социальной проблемой. В 50% случаев нарушение фертильности наблюдается именно у мужчин. Причинами бесплодия могут быть генетические нарушения, а также качественные и количественные изменения показателей эякулята, но в 40% случаев причина бесплодия неизвестна. Такой вид нарушения фертильности принято называть идиопатическим бесплодием. Одной из причин возникновение бесплодия могут быть нарушения в эпигенетической программе половых клеток, обусловленные аномальным метилированием ДНК. (Olszewska et al., 2022; Puzuka, 2021; Xavier , 2019).
Сперматозоиды являются высокоспециализированными клетками, главная функция которых заключается в передаче генетической информации. Однако, помимо генетической информации, они также несут важные эпигенетические метки, которые могут влиять на экспрессию генов в зиготе и на ранних стадиях развития эмбриона. (Hammoud et al., 2009). Активную роль в установлении специфического эпигенетического профиля клеток сперматогенного ряда играют процессы метилирования и деметилирования ДНК (Reik, Surani, 2015). Метилирование ДНК представляет собой присоединение метильной группы к пятому положению цитозина в динуклеотиде 5’-CpG-3’ за счёт работы группы ферментов ДНК-метилтранфераз (Luo et al., 2018). Деметилирование ДНК - процесс обратный метилированию ДНК и может происходить в клетке как пассивно, так и активно. Пассивное потеря метильных групп происходит в ходе репликации ДНК. В процессе активного деметилирования задействована ферментативная система белков семейства TET – TET1, TET2 и TET3, которые катализируют последовательные преобразования 5-метилцитозина (5mC) в 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), затем в 5-формилцитозин (5fC) и далее в 5-карбоксилцитозин (5caC) (Tahiliani et al., 2009). В результате запускается механизм эксцизионной репарации (BER-механизм (base-excision repair)) с участием гликозилаз TDG и SMUG, и 5-карбоксилцитозин наравне с 5-формилцитозином вырезаются из цепи ДНК с образованием апиримидиновых сайтов, которые затем заменяются на цитозин (Maiti A., 2011). Активное деметилирование также может происходить в результате прямого окисления активными формами кислорода (АФК) 5-метилцитозина до его производных. При этом важно отметить, что 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) был первоначально признан как промежуточный продукт в процессе активного деметилирования ДНК. Однако, современные исследования показали, что 5hmC выполняет самостоятельные функции, например, принимая участие в регуляции экспрессии генов, изменяя структуру хроматина и доступность ДНК для транскрипционных факторов, то есть действовать как эпигенетический маркер, способствующий активации работы генов (Pastor, Pape, Huang, 2013).
На характер метилированния ДНК сперматозоидов оказывают влияние экзо- и эндогенные факторы, что объясняет некоторую пластичность механизма метилирования ДНК на определенных этапах развития мужских половых клеток и их последовательной дифференцировки от сперматогониев в сперматоциты, сперматиды, а в итоге в сперматозоиды (Aitken R. J. et al. 2014). Факторы среды способны оказывать негативное влияние на функциональные и морфологические характеристики сперматозоидов, способствуя увеличению концентрации в эякуляте свободных активных форм кислорода, что в итоге нарушает баланс между их количеством и антиоксидантным потенциалом клетки. При избытке активных форм кислорода могут возникать нарушения в сперматозоидах в результате индукции оксидативного повреждения как липидов, белков, так и нарушения целостности ДНК с возникновением разрывов. (Aitken R. J., et al., 2016). АФК также способны напрямую окислять 5mC с образованием 5hmС. Однако точная причина возникновения индивидуальных сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК пока не известна (Efimova et al., 2017).
Таким образом, целью работы является изучение взаимосвязи процессов активного деметилирования ДНК и фрагментации ДНК при нормо- и патоспермии.
Для реализации цели поставлены следующие задачи:
1. Определить долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК в разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик
2. Определить долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК в разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинтических характеристик
3. Определить долю сперматозоидов одновременно с фрагментированной и гидроксиметилированной ДНК разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик
4. Определить и провести сравнительный анализ уровня содержания тотальной и ТЕТ1, ТЕТ2, ТЕТ3 кодирующих РНК в разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик
5. Проанализировать взаимосвязь между нарушениями целостности ДНК и гидроксиметилированием ДНК в сперматозоидах из разных фракций эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик.
Сперматозоиды являются высокоспециализированными клетками, главная функция которых заключается в передаче генетической информации. Однако, помимо генетической информации, они также несут важные эпигенетические метки, которые могут влиять на экспрессию генов в зиготе и на ранних стадиях развития эмбриона. (Hammoud et al., 2009). Активную роль в установлении специфического эпигенетического профиля клеток сперматогенного ряда играют процессы метилирования и деметилирования ДНК (Reik, Surani, 2015). Метилирование ДНК представляет собой присоединение метильной группы к пятому положению цитозина в динуклеотиде 5’-CpG-3’ за счёт работы группы ферментов ДНК-метилтранфераз (Luo et al., 2018). Деметилирование ДНК - процесс обратный метилированию ДНК и может происходить в клетке как пассивно, так и активно. Пассивное потеря метильных групп происходит в ходе репликации ДНК. В процессе активного деметилирования задействована ферментативная система белков семейства TET – TET1, TET2 и TET3, которые катализируют последовательные преобразования 5-метилцитозина (5mC) в 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), затем в 5-формилцитозин (5fC) и далее в 5-карбоксилцитозин (5caC) (Tahiliani et al., 2009). В результате запускается механизм эксцизионной репарации (BER-механизм (base-excision repair)) с участием гликозилаз TDG и SMUG, и 5-карбоксилцитозин наравне с 5-формилцитозином вырезаются из цепи ДНК с образованием апиримидиновых сайтов, которые затем заменяются на цитозин (Maiti A., 2011). Активное деметилирование также может происходить в результате прямого окисления активными формами кислорода (АФК) 5-метилцитозина до его производных. При этом важно отметить, что 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) был первоначально признан как промежуточный продукт в процессе активного деметилирования ДНК. Однако, современные исследования показали, что 5hmC выполняет самостоятельные функции, например, принимая участие в регуляции экспрессии генов, изменяя структуру хроматина и доступность ДНК для транскрипционных факторов, то есть действовать как эпигенетический маркер, способствующий активации работы генов (Pastor, Pape, Huang, 2013).
На характер метилированния ДНК сперматозоидов оказывают влияние экзо- и эндогенные факторы, что объясняет некоторую пластичность механизма метилирования ДНК на определенных этапах развития мужских половых клеток и их последовательной дифференцировки от сперматогониев в сперматоциты, сперматиды, а в итоге в сперматозоиды (Aitken R. J. et al. 2014). Факторы среды способны оказывать негативное влияние на функциональные и морфологические характеристики сперматозоидов, способствуя увеличению концентрации в эякуляте свободных активных форм кислорода, что в итоге нарушает баланс между их количеством и антиоксидантным потенциалом клетки. При избытке активных форм кислорода могут возникать нарушения в сперматозоидах в результате индукции оксидативного повреждения как липидов, белков, так и нарушения целостности ДНК с возникновением разрывов. (Aitken R. J., et al., 2016). АФК также способны напрямую окислять 5mC с образованием 5hmС. Однако точная причина возникновения индивидуальных сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК пока не известна (Efimova et al., 2017).
Таким образом, целью работы является изучение взаимосвязи процессов активного деметилирования ДНК и фрагментации ДНК при нормо- и патоспермии.
Для реализации цели поставлены следующие задачи:
1. Определить долю сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК в разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик
2. Определить долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК в разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинтических характеристик
3. Определить долю сперматозоидов одновременно с фрагментированной и гидроксиметилированной ДНК разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик
4. Определить и провести сравнительный анализ уровня содержания тотальной и ТЕТ1, ТЕТ2, ТЕТ3 кодирующих РНК в разных фракциях эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик
5. Проанализировать взаимосвязь между нарушениями целостности ДНК и гидроксиметилированием ДНК в сперматозоидах из разных фракций эякулята в зависимости от их морфокинетических характеристик.
Настоящая работа выполнена в рамках исследования по поиску причин идиопатического бесплодия. Комплексный подход, основанный на анализе в одних и тех же гаметах целостности ДНК и ее гидроксиметилирования, позволил установить, что эти процессы взаимосвязаны. Установлено, что во фракции сперматозоидов с наилучшими морфокинетическими характеристиками наблюдается наименьшее количество клеток с фрагментированной и гидроксиметилированной ДНК, в то время как во фракциях нативного эякулята и аномальных сперматозоидов эти показатели значительно выше. Корреляционный анализ между долями клеток с фрагментированной ДНК и гидроксиметилированной ДНК во фракции сперматозоидов с аномальными морфокинетическими характеристиками показал сильную положительную взаимосвязь между процессами гидроксиметилирования и нарушения целостности ДНК, что свидетельствует о том, что оба этих процесса имеют единый триггер, которым, вероятнее всего, является активный кислород, воздействующий на гаметы во время оксидативного стресса и приводящий как к изменениям в эпигеноме, в виде окисления 5-метилцитозина (5mC) до 5-гидроксиметилцитозина (5hmC), так и к возникновению разрывов в цепях ДНК. В результате сравнительного анализа уровня содержания тотальной РНК во фракциях сперматозоидов с нормальными и аномальными морфокинетическими параметрами было выявлено, что наибольшая концентрация РНК характерна для сперматозоидов с нарушенными морфокинетическими характеристиками, что позволяет охарактеризовать данный критерий как негативный биомаркер. Выявление относительного количества ТЕТ1, ТЕТ2, ТЕТ3 кодирующих РНК во фракциях нормальных и аномальных сперматозоидов и последующий сравнительный анализ позволили установить, что экспрессия гена ТЕТ1 вероятнее всего не характерна для клеток сперматогенного ряда, а ТЕТ-опосредованное активное деметилирование является одной из причин появления гамет с гидроксиметилированной ДНК и ассоциировано с нарушениями сперматогенеза. Таким образом, данные, полученные в ходе исследования, позволили не только предположить причины гидроксиметилирования ДНК в эякулированных сперматозоидах, но и выявить новые потенциальные биомаркеры качества сперматозоидов, что создаёт предпосылки к дальнейшему изучению механизмов эпигенетического репрограммирования половых клеток, а также поиску причин и средств лечения мужского бесплодия.
