возможности золотых пористых встречно-штыревых
электродов, сенсорная платформа для определения
олигонуклеотидов, электроды, анализы для
определения ДНК, РНК и олигонуклеотидов, циклическая вольтамперометрия
Олигонуклеотиды - это короткие последовательности нуклеотидов, которые имеют множество важных биологических функций. Они играют значимую роль в генетике, иммунологии, диагностике и терапии заболеваний. В медицине количественное определение олигонуклеотидов является критически важным для диагностики и лечения многих заболеваний.
На данный момент в медицинской практике наиболее часто применяется полимерная цепная реакция (ПЦР) (англ. PCR) как основной метод определения олигонуклеотидов. Со времени создания и по сегодняшний день, меньше, чем за 50 лет, ПЦР-анализ уже внёс ощутимый вклад в массовую диагностику инфекционных, вирусных и бактериальных заболеваний, благодаря относительной быстроте и высокой специфичности. Большинство методов ПЦР основаны на термическом циклировании, вследствие которого происходит увеличение целевых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) до размеров от 100 до 10000 пар оснований. По количеству амплифицированного продукта и происходит дальнейшее изучение или анализ целевого фрагмента олигонуклеотида. Основные варианты исполнения анализа методом ПЦР являются качественными методами анализа содержания олигонуклеотидов в биологической матрице. Исключением можно считать вариант исполнения количественного ПЦР (qPCR), который, в свою очередь, так же имеет большое число модификаций. Такой метод позволяет не только детектировать наличие целевой последовательности олигонуклеотидов в образце, но и измерять их количество. Кроме того, ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) отслеживает увеличение целевого фрагмента ДНК во время полимерной цепной реакции и может использоваться для полуколичественной и количественной оценки содержания целевого фрагмента олигонуклеотида. Для проведения количественного определения олигонуклеотидов методом ПЦР используются неспецифичные по отношению к целевой молекуле интеркалирующие красители и специфичные ДНК-зонды, вызывающие флуоресценцию. Вследствие использования более
дорогостоящего оборудования и реагентов для количественного определения олигонуклеотидов, стоимость анализа повышается.
Использование электрохимических методов анализа для количественного определения олигонуклеотидов является перспективным направлением развития диагностики заболеваний вследствие дешевизны приборного исполнения анализа и достаточной быстроты его выполнения. Поэтому разработка миниатюрных электрохимических сенсоров для количественного определения олигонуклеотидов является актуальной в сегодняшнее время задачей. Примером таких сенсоров являются сенсоры, основанные на комплементарном связывании олигонуклеотида-ловушки с целевым олигонуклеотидом-аналитом. Одним из способов повышения чувствительности электрохимического детектирования олигонуклеотидов является использование в качестве сенсорной платформы встречно-штыревых электродов. Ранее было описано использование встречно-штыревых электродов из гладкого золота для количественно определения олигонуклеотидов - биомаркеров заболеваний. Дальнейшее улучшение аналитических характеристик подобных сенсоров может быть достигнуто с увеличением удельной поверхности электрода, за счёт использования пористых материалов. Увеличение удельной поверхности ВШЭ в данной работе было достигнуто за счёт использования электродов из пористого золота, ранее подобные структуры с изучены не были.
Цель настоящей работы состоит в изучении электрохимического поведения золотых пористых ВШЭ в качестве сенсорной платформы для количественного определения олигонуклеотидов и оценке аналитических характеристик разработанного сенсора по отношению к модельным аналитам. Для достижения целей данной работы впервые были изготовлены золотые пористые ВШЭ методом фотолитографии в вакууме. Исследование электрохимического поведения этого нового типа электродов (новой сенсорной платформы) носит фундаментальный характер, так как на основе полученных знаний возможна разработка сенсоров для определения широкого круга аналитов.
В данной работе были исследованы возможности золотых пористых встречно- штыревых электродов в качестве сенсорной платформы для количественного определения олигонуклеотидов. Результаты работы привели к следующим выводам:
1. Была проведена характеризация поверхности золотых пористых ВШЭ, специально изготовленных для целей работы: были установлены геометрические размеры штырей (7.5 мкм) и зазоров (4.5 мкм), рассчитана геометрическая площадь рабочей области электрода (7.51*10-3 см2), а также определён диапазон размеров пор (30 - 160 нм).
2. На основе золотых пористых ВШЭ были разработаны двух- и трёхэлектродные сенсоры для количественно определения олигонуклеотида - биомаркера гриппа типа А с регистрацией аналитического сигнала методом спектроскопии электрохимического импеданса.
3. Оба сенсора имеют линейный диапазон от 10-9 М до 10-15 М и предел обнаружения 1015 М олигонуклеотида - биомаркера гриппа типа А.
4. Чувствительность двухэлектродного сенсора в три раза выше, чем чувствительность трёхэлектродного сенсора: 91.61 Ом/М против 27.07 Ом/М, соответственно.
5. Сравнение трёхэлектродного сенсора на основе пористого ВШЭ с аналогичным сенсором на основе коммерчески-доступного гладкого ВШЭ показало, что сенсор на основе пористого ВШЭ при концентрации аналита 10-9 М позволяет регистрировать в 5 раз больший аналитический сигнал.
Кроме того, следует отметить, что изученные новые электроды - золотые пористые ВШЭ, - являются универсальной сенсорной платформой и могут быть применены для количественного определения множества других биомаркеров опасных заболеваний, а также в качестве сенсорной платформы для разработки газовых сенсоров.
