Введение 4
Глава 1 Обзор литературы 6
1.1 Конформация молекулы ДНК в растворе 6
1.2 Общие сведения о ДНК-белковом взаимодействии 7
1.3 Биологическая активность коротких белков 8
Глава 2 Материалы и методы 11
2.1 Общая характеристика материалов 11
2.2 Спектрофотометрия 12
2.4 Низкоградиентная вискозиметрия 14
2.5 Флуоресцентная спектроскопия 16
2.6 Метод изотермического калориметрического титрования 17
2.7 Метод ядерного магнитного резонанса 18
Глава 3 Результаты и обсуждение 20
3.1 Исследование влияния пептида AEDL на конформацию ДНК 20
3.1.1 Спектрофотометрия 20
3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия 25
3.1.3 Низкоградиентная вискозиметрия 27
3.1.4 Калориметрия 29
3.1.5 ЯМР 31
3.2 Исследование влияния пептида EDR на конформацию ДНК 33
3.2.1 Спектрофотометрия 33
3.2.2 Флуоресцентная спектроскопия 35
3.2.3 Калориметрия 37
3.2.5 ЯМР 39
3.3 Исследование влияния пептида KEDW на конформацию ДНК 40
3.3.1 Спектрофотометрия и КД 40
3.3.2 Флуоресцентная спектроскопия 42
3.3.3 Низкоградиентная вискозиметрия 43
3.3.4 Калориметрия 44
3.3.5 ЯМР 46
Заключение 47
Выводы 49
Список литературы 50
Приложение А. H-спектры и спектры WaterLOGSY для комплексов пептида AEDL c олигонуклеотидами. 56
Приложение Б. H-спектры и спектры WaterLOGSY для комплексов пептида EDR c олигонуклеотидами. 59
Приложение В. H-спектры и спектры WaterLOGSY для комплексов пептида KEDW c олигонуклеотидами. 61
Приложение Г. H-спектры олигонуклеотидов DNA 1, DNA2, DNA3. 64
Существует связь между биологическим старением организма и замедлением метаболических процессов в клетках, что, в свою очередь, обусловлено множеством факторов. Одним из таких факторов является понижение интенсивности транскрипции ДНК.
Короткие пептиды, способны проникать через клеточные мембраны, влиять на эпигенетические процессы в клеточном ядре, и, как следствие, оказывать влияние на пролиферацию и дифференцировку клеток, осуществляемой факторами транскрипции.
В работах Хавинсона В.Х с соавторами было показано, что что некоторые короткие пептиды, являющиеся аналогами пептидов, выделенных из тканей животных, способны стимулировать синтез белка в клетках и усиливать экспрессию генов. Также, осуществляя регуляцию активности теломераз, пептиды способствуют элонгации теломер в соматических клетках человека. Изучаемые в работе пептиды были получены в группе Хавинсона В.Х.
Целью настоящей работы являлось исследование возможности образования комплексов коротких пептидов с ДНК в растворе и изучение их влияния на конформацию ДНК в растворе.
Образование комплексов может повлиять как на вторичную, так и на третичную структуру ДНК, поэтому для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучение спектральными методами изменений конформации ДНК при связывании с пептидами на уровне вторичной структуры макромолекулы.
Изучение влияния пептидов на третичную структуру ДНК
Определение термодинамических параметров связывания пептидов с ДНК
Для решения поставленных задач были использованы спектральные, гидродинамические, микрокалориметрические методы исследования и метод ЯМР.
В ходе данной работы были изучены комплексы ДНК с короткими пептидами, а также установлено влияние пептидов на вторичную и третичную структуру ДНК. Для изучения использовался широкий спектр методов, в числе которых были спектральные, гидродинамические и калориметрические.
На основании полученных данных, можно заключить, что пептиды AEDL, EDR и KEDW связываются с ДНК, что видно по отличию спектров поглощения комплекса от суммы спектров компонент. Так же по наличию гиперхромного эффекта можно судить о частичной дестабилизации молекулы ДНК.
Если принимать во внимание спектры поглощения комплексов ДНК-AEDL в присутствии ионов меди, можно сделать предположение, что связывание этого пептида происходит по тем же сайтам связывания, что и связывание ионов меди.
Это предположение подтверждается данными, полученными методом флуоресцентной спектроскопии. Предполагается, что связывание пептида AEDL происходит по большой бороздке ДНК. В то же время, увеличение концентрации пептида EDR увеличивает долю красителя DAPI, связанного с ДНК по малой бороздке, и уменьшает долю DAPI, связанного по фосфатам. Это указывает на отсутствие связывания пептида EDR в малой бороздке ДНК. По спектрам флуоресценции пептида KEDW можно отметить корреляцию с данными, полученными из спектров поглощения комплекса KEDW-ДНК.
Методом калориметрического титрования для пептидов AEDL и KEDW удалось выяснить, что при больших концентрациях пептидов наблюдается уменьшение энтальпии связывания, что свидетельствует о «насыщении» мест связывания, а уменьшение энтропии свидетельствует о вытеснении молекул растворителя из ДНК и образовании комплекса. Однако, мы этим методов мы исследовали комплексообразование при достаточно больших концентрациях пептида, поэтому нельзя исключать наличие других типов связывания пептидов с ДНК в другом диапазоне концентраций.
Метод низкоградиентной вискозиметрии при исследовании пептидов AEDL, EDR и KEDW показывает относительное уменьшение характеристической вязкости при увеличении концентрации пептидов, что является следствием уменьшения объема молекулярного клубка.
Совокупность результатов исследования показывает, что пептиды взаимодействуют с ДНК в растворе, оказывая различные эффекты на вторичную и третичную структуру макромолекулы.
В обзоре литературы приведены примеры исследований, которые указывают на биологическую активность пептидов AEDL, EDR и KEDW, выражающуюся в эпигенетической регуляции экспрессии генов. Таким образом, исследования влияния пептидов на конформацию ДНК является важным этапом в изучении механизмов воздействия коротких пептидов на соматические клетки.
