Содержание
Введение 4
1. Обзор литературы 5
1.1. Общая характеристика цианобактерий 5
1.2. Фотосинтетический аппарат и пигменты цианобактерий 10
1.3. Проблемы систематики цианобактерий 11
2. Материалы и методы исследования 14
2.1.Объекты исследования 14
2.2. Культивирование цианобактерий 15
2.3. Морфологический анализ 15
2.4. Анализ пигментного состава 15
2.5. Выделение ДНК 16
2.5.1 СТАВ-метод 16
2.5.2. STET-метод 17
2.6. Полимеразная цепная реакция 17
2.7. Электрофорез в агарозном геле 18
2.8. Очистка ДНК-фрагментов 19
2.9. Секвенирование 19
2.10. Филогенетический анализ 19
2.11. Анализ последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров
рибосомного оперона 20
3. Результаты и обсуждение 21
3.1. Морфологический анализ штаммов рабочей коллекции 21
3.2. Анализ пигментного состава 28
3.3. Молекулярно-филогенетический анализ исследуемых штаммов 32
3.4. Анализ последовательностей ITS рибосомного оперона 41
Заключение 43
Выводы 45
Список литературы 46
Приложение 1 52
Приложение 2 54
Приложение 3 60
Цианобактерии - древняя группа прокариотных микроорганизмов, обладающих способностью к фотосинтезу. По самым ранним оценкам, их происхождение берет начало в архейском периоде 3,5 - 3,8 млрд лет назад. Цианобактерии значительно повлияли на формирование экосистем, участвуя в создании оксигенной атмосферы, необходимой для размножения аэробных организмов. Также цианобактерии до сих пор являются одними из самых распространенных первичных продуцентов и считаются предшественниками пластид водорослей и растений. Сложно переоценить роль цианобактерий в образовании и развитии биосферы Земли.
Для исследования столь значимых объектов создаются и поддерживаются коллекции культивируемых штаммов. Набиолее известными и авторитетными являются коллекция цианобактерий РСС Института Пастера (Франция), Американская коллекция типовых культур АТСС (США), NIES (Япония), ряд других Европейских коллекций (SAG, NIVA, CCALA и другие). Одной крупных коллекций является коллекция культур цианобактерий, водорослей и паразитов водорослей СПбГУ (CALU, Collection of Algae of Leningrad University). В ней поддерживается всего около 1500 штаммов микроорганизмов, из которых 511 - цианобактерии. Коллекция постоянно пополняется новыми штаммами, выделяемыми из разнообразных экологических ниш.
Целью нашей работы является описание и идентификация нескольких новых штаммов цианобактерий из коллекции CALU. Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Выделение чистых культур цианобактерий и формирование рабочей коллекции штаммов;
2. Изучение морфологии клеток и особенностей жизненного цикла исследуемых штаммов;
3. Анализ пигментного состава;
4. Филогенетический анализ исследуемых штаммов с использованием последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и участков внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) рибосомного оперона.
5. Идентификация и уточнение систематического положения штаммов рабочей коллекции.
В результате наблюдения за развитием культур, изучения морфологии и пигментного состава, проведения молекулярно-филогенетического анализа нам удалось идентифицировать до вида несколько исследуемых штаммов. В частности, штаммы Chroococcus sp. CALU 1885 и Chroococcus sp. CALU 1886, а также новый изолят CALU 1939 по совокупности исследованных признаков отнесены к виду Chroococcus minutus. Новые штаммы мелких одноклеточных цианобактерий идентифицированы как Altericista lacusladogae (CALU 1938), Cyanobium gracile (CALU 1945), Geminocystis urbisnovae (CALU 1946).
Пересмотрено систематическое положение штамма Gloeocapsa sp. CALU 1842, который по результатам генотипирования отнесен к р. Chalicogloea и принадлежит к новому виду этого рода.
Новые Synechocystis-подобные штаммы цианобактерий CALU 1940, CALU 1942 и CALU 1943 на основе полученных нами данных отнесены к р. Altericista. Анализ последовательностей гена 16S рРНК и ITS рибосомного оперона позволяет рассматривать их как представителей двух новых видов этого рода, один из которых может быть описан на основе штамма CALU 1943, а другой - штаммов CALU 1940 и CALU 1942.
По совокупности гено- и фенотипических признаков штаммы CALU 1941 и CALU 1944 отнесены нами к р. Pseudanabaena. Поскольку последовательности их гена 16S рРНК не обнаруживали близкого сходства с представителями известных видов этого рода, мы не смогли идентифицировать наши штаммы до вида. Известно, что род Pseudanabaena полифилетичен и, возможно, скоро будет реструктурирован с выделением новых монофилетичных таксонов.
Наибольшее затруднение вызывает идентификация штаммов CALU 1878 и CALU 1947 плеврокапсовых цианобактерий. Отнесение их по совокупности морфологических признаков к р. Myxosarcina и р. Pleurocapsa соответственно не согласуется с результатами анализа последовательностей гена 16S рРНК. Из-за сложности организации этой группы цианобактерий не всегда исследователям удается зарегистрировать все морфологические формы клеток, при культивировании в лабораторных условиях морфология и жизненный цикл также могут меняться. Поэтому могут возникнуть трудности и ошибки при идентификации видов на основе морфологических признаков. Для большинства описанных на морфологическом уровне родов плеврокапсовых не проведено генотипирование типовых видов, в некоторых случаях это невозможно из-за утери исходных гербарных материалов. В составе отдельных ветвей филогенетического древа представителей плеврокапсовых цианобактерий встречаются штаммы с разной родовой 43
принадлежностью (Shalygin et al., 2019). В итоге проанализированные последовательности генома идентифицированных по морфологическим признакам штаммов р. Pleurocapsa и р. Myxosarcina не организуются в компактные кластеры. Поэтому мы предлагаем сохранить для штаммов CALU 1878 и CALU 1947 в каталоге коллекции CALU родовую принадлежность, определенную на основе морфологических признаков, а исследования этих штаммов будут продолжены.
