1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИСКУССТВЕННАЯ ХРОМОСОМА ЧЕЛОВЕКА
0. Введение - 5
1.1.0 Искусственная хромосома человека - 7
1.1.1 Первая ИХЧ, составленная из прицентромерных альфосателитных повторов -9
1.1.2 21 ИХЧ – 12
1.1.3 ИХЧ с условным кинетохорм -14
ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
1.2.0 Перспективы использования плюрипотентных стволовых клеток - 15
1.2.1 Получение плюрипотентных клеток - 15
1.2.2 Моделирование заболеваний на ПСК клетках - 16
1.2.3 Особенности применения ПСК в клинической практике -18
1.2.4 Случаи успешного применения ПСК-терапии в клинике- 19
1.2.5 Аспекты регулирования применения ПСК-терапии – 22
ВИРУСНЫЕ МЕТОДЫ ДОСТАВКИ
1.3.0 Вирусные методы доставки трансгена в генной терапии -23
1.3.1 Первые вирусные векторы - 23
1.3.2.0 Современные вирусные векторы - 23
1.3.2.1 Лентивирусный вектор - 23
1.3.2.2 Адено-ассоциированный вирусный вектор - 24
1.3.2.3 Вектор на основе вируса герпеса - 25
1.3.2.4 Вектор на основе вируса оспы - 25
1.3.1 Применение лентивирусных и ретровирусных векторов в клинической практике -26
1.3.2 Клиническое применение аденоассоциированного вирусного вектора - 27
1.3.3 Клинические приминения неинтегративных вирусные векторов - 28
НЕВИРУСНЫЕ МЕТОДЫ ДОСТАВКИ
1.4.1 Невирусные методы доставки - 28
1.4.2 Улучшение невирусных векторов доставки - 32
1.4.3 Совмещение вирусных и невирусных метод доставки для максимальной оптимизации генной терапии – 33
ГЕМОФИЛИЯ – 33.
2 Материалы и методы -35
2.1 Молекулярное клонирование. -35
2.1.2-Рестрикция плазмиды вектора -36
2.1.3 Лигирование и трансформация 37
2.1.4 Проведение рестрикции с Hind3. -40
2.2 Временная трансфекция ИПС клеток и проверка экспрессии F8 фактора -40
2.2.2 Проведение Вестерн-блоттинга – 41.
2.3 Интеграция плазмиды с F8 фактором за счёт cre-lox рекомбинации в ИХЧ -42
2.3.3)Флуоресцентная гибридизация на стекле(FISH) – 45
2.3.4. ПЦР анализ ДНК CHO клеток с праймерами на ген F8 и CMV промотор -46
2.3.5 ПЦР анализ на наличие Cre-рекомбиназной вставки -47
3. РЕЗУЛЬТАТЫ -48
3.1. Молекулярное клонирование – 48
3.2 Временная трансфекция ИПС – 49
3.2.2 - Вестерн-блоттинг - 50
3.3Характеристика CHO клонов -51
3.3.1 Характеристика CHO клонов по GFP сигналу -51
3.3.2 ПЦР ДНК CHO клонов с парймерами на трансгенную вставку – 51
3.3.3 ПЦР с праймерами на ген Cre-рекомбиназы – 52
3.3.4 Вестерн-блоттинг CHO клонов. -52
3.3.5 FISH гибридизация - 52
Итоговая таблица характеристики СНО клонов – 53
Выводы – 55
Список литературы – 56
Гемофилия А является распространённым генетическим заболеванием (1-2 больных на 10 000 в разных популяциях), вызванным мутациями в гене фактора свёртываемости VIII (F8). Традиционный метод лечения заболевания, переливание крови, позднее заменённый инъекциями FVIII (фактор заместительная терапия).
Разрабатываются гено-терапевтические методы лечения. Лечения гемофилии за счёт адено-ассоциированного вирусного вектора (ААВ) показал многообещающие результаты на мышах (ссылка). Тем не менее, генная терапия с использованием вирусных векторов имеет побочные эффекты, такие как воспалительная реакция и инсерционный мутагенез. ИХЧ характеризуется потенциально неограниченной емкостью, стабильной экспрессией трансгена и отсутствием недостатков вирусных методов доставки (ссылка). Ранее было продемонстрировано использование ИХЧ для лечения миодистрофии Дюшен (ссылка)а. В связи со всем вышеперечисленным разрабатывается метод лечения гемофилии с использованием ИХЧ.
До нашей работы в лаборатории была получена ИХЧ с расположенными «голова к голове» генами F8 и EGFP под промоторами CMV и CAG соответственно. Наблюдалась продукция FVIII фактора в клетках линии CHO, но продукция FVIII фактора в в индуцированных плюрипотентных клетках отсутствовала. В статье (Sangmi Chunga et al, 2002) было показано, что ген с CMV (цитомегаловирус) промотором экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках на очень низком уровне (примерно 1% от уровня экспрессии гена с EF промотором). Кроме того в статье (Kouichi Hasegawa et al, 2002) было показано интерференция промотора CAG на тканеспецифичный промотор при расположении генов голова к хвосту. В результате такой интерференции более слабый тканеспецифичный промотор не экспрессировался. При разделении промоторных участков инсулятором cHS4(куриный HS4 инсулятор) ген под CAG промотором и ген под тканеспецифичным промотором нормально экспрессирвоались.
1) Замена промотора CMV на промотор EF1-α с добавлением инсулятора cHS4 способствует эффективной экспрессии гена фактора VIII свертывания крови (F8) в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках гемольной мыши (JAX Mice STRAIN DATASHEET - 004424).
2) Отобранные клоны клеток линии CHO подходят по ключевым критериям для дальнейшей работы с искусственной хромосомой человека, несущей ген фактора VIII свертывания крови (F8).
