📄Работа №138770
Тема: Анализ теплового сдвига для открытия новых ингибиторов карбоангидразы IX
Тип работы
Бакалаврская работа
Предмет
химия
Объем:
57 листов
Год:
2023
Просмотров:
61
4800
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
Аннотация 2
Определения, обозначения и сокращения 5
Введение 6
1 Литературный обзор 8
1.1 Общая характеристика карбоангидраз IX и XII 8
1.2 Экспрессия и функция карбоангидраз в опухолевых клетках 10
1.2.1 Связь CAIX с гипоксией и ацидозом 11
1.2.2 CAXII: распространение и роль в онкогенезе 14
1.3 Ингибиторы карбоангидразы IX 15
1.4 Анализ термического сдвига 23
1.5 Метод проточной цитометрии 28
2 Результаты и их обсуждение 35
2.1 Определение температуры плавления белка интереса 36
2.2 Оптимизация условий и скрининг лигандов 37
3 Экспериментальная часть 43
3.1 Объект исследования 43
3.2 Оборудование и материалы 45
3.4 Методика эксперимента 46
3.4.1 Получение клональных клеточных линий 46
3.4.2 Анализ клеточного теплового сдвига 47
3.4.3 MTT-тест 47
Заключение 48
Список используемой литературы 49
Приложение А Результаты оптимизации CETSA 56
Определения, обозначения и сокращения 5
Введение 6
1 Литературный обзор 8
1.1 Общая характеристика карбоангидраз IX и XII 8
1.2 Экспрессия и функция карбоангидраз в опухолевых клетках 10
1.2.1 Связь CAIX с гипоксией и ацидозом 11
1.2.2 CAXII: распространение и роль в онкогенезе 14
1.3 Ингибиторы карбоангидразы IX 15
1.4 Анализ термического сдвига 23
1.5 Метод проточной цитометрии 28
2 Результаты и их обсуждение 35
2.1 Определение температуры плавления белка интереса 36
2.2 Оптимизация условий и скрининг лигандов 37
3 Экспериментальная часть 43
3.1 Объект исследования 43
3.2 Оборудование и материалы 45
3.4 Методика эксперимента 46
3.4.1 Получение клональных клеточных линий 46
3.4.2 Анализ клеточного теплового сдвига 47
3.4.3 MTT-тест 47
Заключение 48
Список используемой литературы 49
Приложение А Результаты оптимизации CETSA 56
📖 Введение
В настоящее время особое внимание уделяется поиску и разработке малых молекул, способных моделировать функцию белка, с целью исследования биологических процессов и применения в качестве терапевтических средств. Большинство стратегий изучения белок-лигандного взаимодействия трудоемки, малопроизводительны или не предоставляют доказательств связывания лиганда с мишенью в клеточной среде. Биохимические методы, основанные на тепловом сдвиге, такие как дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF), определяет лиганд- индуцированные тепловые сдвиги с использованием рекомбинантного белка с гидрофобными красителями, однако данный подход не учитывает сложности, обнаруживаемые в клетках, включая мембранные барьеры и возможность нецелевого связывания.
В 2013 году Martinez Molina и соавторы представили запатентованный анализ клеточного теплового сдвига (CETSA) для количественной оценки взаимодействия с мишенью в клетках путем изучения влияния связывания соединения на термостабильность белков. Поскольку ни соединение, ни белок не модифицируются, CETSA обеспечивает надежное измерение взаимодействия с мишенью в физиологических условиях. Биологически значимые данные о воздействии на мишень могут быть получены из любого типа клеточных матриц, таких как клеточные линии, ткани животных и образцы пациентов, что делает метод применимым на всех этапах процесса открытия и разработки лекарств.
Карбоангидраза IX (CAIX) считается подходящей мишенью для различных противоопухолевых стратегий, потенциал этого фермента как важного класса биологических объектов для химиотерапевтического вмешательства была признана несколько десятилетий назад. Это белок клеточной поверхности, который экспрессируется в гипоксических солидных опухолях человека, где играет ключевую роль в регуляции микроокружения, тем самым способствуя выживанию, пролиферации, метастазированию и развитию лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Поэтому поиск ингибиторов CAIX может послужить перспективным терапевтическим подходом в противораковой терапии.
Цель работы: апробация тест-системы с применением проточной цитометрии для оценки ингибиторов карбоангидразы IX.
Задачи работы:
1. Получить трансфецированную клеточную линию, экспресирующую экспресирующую CAIX-GFP;
2. Оптимизировать условия анализа клеточного теплового сдвига;
3. Провести анализ клеточного теплового сдвига на клеточной линии HEK293, стабильно экспрессирующей CAIX-GFP
4. Исследовать возможные корреляции сигнала флуоресценции с ингибирующей способностью библиотеки соединений.
В 2013 году Martinez Molina и соавторы представили запатентованный анализ клеточного теплового сдвига (CETSA) для количественной оценки взаимодействия с мишенью в клетках путем изучения влияния связывания соединения на термостабильность белков. Поскольку ни соединение, ни белок не модифицируются, CETSA обеспечивает надежное измерение взаимодействия с мишенью в физиологических условиях. Биологически значимые данные о воздействии на мишень могут быть получены из любого типа клеточных матриц, таких как клеточные линии, ткани животных и образцы пациентов, что делает метод применимым на всех этапах процесса открытия и разработки лекарств.
Карбоангидраза IX (CAIX) считается подходящей мишенью для различных противоопухолевых стратегий, потенциал этого фермента как важного класса биологических объектов для химиотерапевтического вмешательства была признана несколько десятилетий назад. Это белок клеточной поверхности, который экспрессируется в гипоксических солидных опухолях человека, где играет ключевую роль в регуляции микроокружения, тем самым способствуя выживанию, пролиферации, метастазированию и развитию лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Поэтому поиск ингибиторов CAIX может послужить перспективным терапевтическим подходом в противораковой терапии.
Цель работы: апробация тест-системы с применением проточной цитометрии для оценки ингибиторов карбоангидразы IX.
Задачи работы:
1. Получить трансфецированную клеточную линию, экспресирующую экспресирующую CAIX-GFP;
2. Оптимизировать условия анализа клеточного теплового сдвига;
3. Провести анализ клеточного теплового сдвига на клеточной линии HEK293, стабильно экспрессирующей CAIX-GFP
4. Исследовать возможные корреляции сигнала флуоресценции с ингибирующей способностью библиотеки соединений.
✅ Заключение
Оценка связывания соединения с нативными белками-мишенями в живых клетках крайне желательна на всех этапах разработки лекарственных соединений. Однако изучение белков и их взаимодействий в физиологической среде считается сложной задачей.
В работе рассмотрен и воспроизведен биофизический метод - анализ клеточного теплового сдвига (CETSA). Здесь сообщается о применении CETSA для выявления сродства библиотеки соединений к внутриклеточному связыванию с CAIX. Ряд проведенных экспериментов позволяют рассчитать % стабилизации от контроля для оценки внутриклеточного сродства лиганд- рецептор, измеренного в живых клетках, сохраняя при этом вышеупомянутые преимущества технологии CETSA, а именно физиологически релевантную систему без применения антител.
По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы:
• получена клональная клеточная линия HEK293, стабильно экспрессирующая CAIX-GFP;
• проведен анализ клеточного теплового сдвига (CETSA) на клеточной линии HEK293, стабильно экспрессирующей CAIX-GFP;
• получены корреляции сигнала флуоресценции с ингибирующей способностью исследуемых соединений. Наличие связывающих способностей контрольных лигандов проявлялось в снижении стабильности белка-мишени.
По причине того, что изначально работа велась с ограниченной выборкой соединений, возникла сложность в оценке применимости данного метода. В дальнейшем работа будет направлена на расширение этого экспериментального исследования для изучения его применимости в определении внутриклеточной аффинности связывания с включением значительно расширенной выборки соединений (с афинностью от 0,1 до 1000 нМ) для установления закономерности на более глубоком уровне.
В работе рассмотрен и воспроизведен биофизический метод - анализ клеточного теплового сдвига (CETSA). Здесь сообщается о применении CETSA для выявления сродства библиотеки соединений к внутриклеточному связыванию с CAIX. Ряд проведенных экспериментов позволяют рассчитать % стабилизации от контроля для оценки внутриклеточного сродства лиганд- рецептор, измеренного в живых клетках, сохраняя при этом вышеупомянутые преимущества технологии CETSA, а именно физиологически релевантную систему без применения антител.
По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы:
• получена клональная клеточная линия HEK293, стабильно экспрессирующая CAIX-GFP;
• проведен анализ клеточного теплового сдвига (CETSA) на клеточной линии HEK293, стабильно экспрессирующей CAIX-GFP;
• получены корреляции сигнала флуоресценции с ингибирующей способностью исследуемых соединений. Наличие связывающих способностей контрольных лигандов проявлялось в снижении стабильности белка-мишени.
По причине того, что изначально работа велась с ограниченной выборкой соединений, возникла сложность в оценке применимости данного метода. В дальнейшем работа будет направлена на расширение этого экспериментального исследования для изучения его применимости в определении внутриклеточной аффинности связывания с включением значительно расширенной выборки соединений (с афинностью от 0,1 до 1000 нМ) для установления закономерности на более глубоком уровне.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🖼 Скриншоты
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.