Альтернативные оксидазы Chlamydomonas reinhardtii:регуляция в стрессовых условиях
|
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………… 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….. 7
1.1. Альтернативная оксидаза как компонент электрон-транспортной цепи митохондрии
1.2. Характеристика альтернативных оксидаз (АОХ) высших растений………... 7
1.2.1. Структура и регуляция транскрипции АОХ-генов………………............. 7
1.2.2. Структура и механизмы регуляции активности АОХ белка……............. 12
1.2.3. Функции АОХ…
1.2.3.1. Роль АОХ в контроле метаболического гомеостаза………............. 17
1.2.3.2. Роль АОХ при адаптации к стрессовым воздействиям…………… 18
1.3. Характеристика альтернативных оксидаз (АОХ) Chlamydomonas
reinhardtii
1.3.1. Структура и регуляция транскрипции АОХ-генов……
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………….. 26
2.1. Объекты исследования
2.2. Условия культивирования…
2.3. Количественный анализ экспрессии генов…………………………………… 28
2.3.1. Выделение тотальной РНК………………………………………………... 28
2.3.2. Синтез одноцепочечной кДНК……
2.3.3. ПЦР в режиме реального времени
2.4. Вестерн-блоттинг
2.5. Получение штамма со сниженным уровнем мРНК CRR1…………………… 32
2.5.1. Конструирование последовательностей олигонуклеотидов, специфичных к СRR1…………………………………………………………………. 32
2.5.2. Клонирование двухцепочечной ДНК для экспрессии искусственных
микроРНК…………………………………………………………………... 33
2.5.3. Отбор amiRNA-клонов, содержащих вставку в ориентации, необходимой для экспрессии……………………………………………………... 34
2.5.4. Трансформация C. reinhardtii……………………………………………... 36
2.6. Измерение дыхания клеток…………………………………………………….. 37
2.7. Измерение активных форм кислорода (АФК)………………………………... 37
2.8. Анализ активности каталазы
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Действие кадмия на синтез и активность альтернативной оксидазы
АОХ1…
3.1.1. Действие кадмия на транскрипцию гена АОХ1
3.1.2. Действие кадмия на уровни белка АОХ1………………………………… 41
3.1.3. Действие кадмия на АОХ-зависимое дыхание ………………………….. 42
3.1.4. Действие кадмия на концентрацию внутриклеточных АФК и активность каталазы…
3.2. Действие стрессоров на экспрессию гена АОХ2……………………………… 45
3.2.1. Действие аноксии на транскрипцию гена AOX2………………………… 45
3.2.2. Роль транскрипционного фактора CRR1 в контроле транскрипции гена
АОХ2 47
3.2.3. Действие дефицита меди на транскрипцию гена AОХ2…………………. 49
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Синтез и функционирование альтернативной оксидазы АОХ1 в условиях
стрессового воздействия……………………………………….......................... 51
4.2 Регуляция экспрессии АОХ2 в стрессовых условиях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………….. 7
1.1. Альтернативная оксидаза как компонент электрон-транспортной цепи митохондрии
1.2. Характеристика альтернативных оксидаз (АОХ) высших растений………... 7
1.2.1. Структура и регуляция транскрипции АОХ-генов………………............. 7
1.2.2. Структура и механизмы регуляции активности АОХ белка……............. 12
1.2.3. Функции АОХ…
1.2.3.1. Роль АОХ в контроле метаболического гомеостаза………............. 17
1.2.3.2. Роль АОХ при адаптации к стрессовым воздействиям…………… 18
1.3. Характеристика альтернативных оксидаз (АОХ) Chlamydomonas
reinhardtii
1.3.1. Структура и регуляция транскрипции АОХ-генов……
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………….. 26
2.1. Объекты исследования
2.2. Условия культивирования…
2.3. Количественный анализ экспрессии генов…………………………………… 28
2.3.1. Выделение тотальной РНК………………………………………………... 28
2.3.2. Синтез одноцепочечной кДНК……
2.3.3. ПЦР в режиме реального времени
2.4. Вестерн-блоттинг
2.5. Получение штамма со сниженным уровнем мРНК CRR1…………………… 32
2.5.1. Конструирование последовательностей олигонуклеотидов, специфичных к СRR1…………………………………………………………………. 32
2.5.2. Клонирование двухцепочечной ДНК для экспрессии искусственных
микроРНК…………………………………………………………………... 33
2.5.3. Отбор amiRNA-клонов, содержащих вставку в ориентации, необходимой для экспрессии……………………………………………………... 34
2.5.4. Трансформация C. reinhardtii……………………………………………... 36
2.6. Измерение дыхания клеток…………………………………………………….. 37
2.7. Измерение активных форм кислорода (АФК)………………………………... 37
2.8. Анализ активности каталазы
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Действие кадмия на синтез и активность альтернативной оксидазы
АОХ1…
3.1.1. Действие кадмия на транскрипцию гена АОХ1
3.1.2. Действие кадмия на уровни белка АОХ1………………………………… 41
3.1.3. Действие кадмия на АОХ-зависимое дыхание ………………………….. 42
3.1.4. Действие кадмия на концентрацию внутриклеточных АФК и активность каталазы…
3.2. Действие стрессоров на экспрессию гена АОХ2……………………………… 45
3.2.1. Действие аноксии на транскрипцию гена AOX2………………………… 45
3.2.2. Роль транскрипционного фактора CRR1 в контроле транскрипции гена
АОХ2 47
3.2.3. Действие дефицита меди на транскрипцию гена AОХ2…………………. 49
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Синтез и функционирование альтернативной оксидазы АОХ1 в условиях
стрессового воздействия……………………………………….......................... 51
4.2 Регуляция экспрессии АОХ2 в стрессовых условиях
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Фотосинтезирующие эукариотические микроорганизмы быстро и эффективно
адаптируются к изменениям в окружающей среде. При этом, наличие у этой группы
микроорганизмов митохондрий и хлоропластов предполагает необходимость
координированного функционирования разных компартментов клеток и наличие
компартмент-специфичных механизмов, обеспечивающих эффективную адаптацию к
неблагоприятным факторам. Следует подчеркнуть, что в литературе практически не
обсуждается роль митохондрий в процессах адаптации и тех компонентов митохондрий,
которые обеспечивают защитно-адаптивные реакции фототрофных эукариотических
микроорганизмов в ответ на разные по природе стрессоры. Последнее обстоятельство
ограничивает существующие представления как о механизмах регуляции стрессовых
ответов, так и свойствах белков, функционирующих в митохондриях. В связи с этим
возникает необходимость изучения митохондриальных белков, которые выполняли бы
функцию интеграции метаболического состояния клетки с действием внешних стрессоров.
Один из механизмов клеточной защиты связан с функционированием
альтернативных оксидаз (AОХ), локализованных в митохондриях. Хотя АОХ выявлены у
эукариотических микроорганизмов, растений и грибов, изучались они главным образом у
высших растений (Vanlerberghe et al., 2013). У высших растений существует два типа
генов, кодирующих альтернативные оксидазы: AOX1, которые найдены у всех
проанализированных представителей, и AOX2, которые, по-видимому, ограничены только
двудольными растениями (Polidoros et al., 2009). Альтернативные оксидазы растений
представлены, как правило, многими белками. Так у Arabidopsis их пять: AOX1a, AOX1b,
AOX1c, AOX1d и AOX2. Столь многокомпонентная организация AOX, безусловно,
затрудняет анализ свойств каждого отдельного представителя. Предполагают, что у
высших растений альтернативные оксидазы могут действовать как центральные
регуляторы роста и развития, а также как интеграторы сигналов стрессовых условий
(Clifton et al., 2006; Vanlerberghe, 2013). В геноме модельного микроорганизма
Chlamydomonas reinhardtii выявлено два гена, AOX1 и AOX2, которые локализованы в
разных хромосомах (хромосомы 9 и 3, соответственно). Ген AOX1 C. reinhardtii
расположен в генетическом кластере, участвующем в ассимиляции нитратов (Gerin et. al,
2010, Molen et. al., 2006, Quesada et. al., 1993). Показано, что транскрипция AOX1 C.
reinhardti индуцируется нитратом и репрессируется аммонием, и AOX1-белок вовлечен в
контроль наиболее важных путей метаболизма микроорганизма (Gérin et al., 2010).6
Особенно следует подчеркнуть, что подобная регуляция альтернативной оксидазы
нитратом и аммонием уникальна для C. reinhardtii, а для высших растений характерна
противоположная зависимость: активация аммонием и репрессия нитратом. Вместе с тем,
роль AOX1-белка в стрессовых условиях совершенно не ясна. Сотрудниками лаборатории
впервые показана индукция AOX1 и возрастание доли альтернативного дыхания в
условиях теплового стресса (Zalutskaya, Lapina, Ermilova, 2015). Однако неизвестно,
какова роль AOX1 в условиях гипертермии, и вовлечена ли эта альтернативная оксидаза у
C. reinhardtii в защитно-адаптивные ответы микроорганизма на другие стрессовые
воздействия. Более ранние исследования некоторых авторов по анализу транскрипции
AOX1 в условиях незначительного снижения температуры (до 18°C) и окислительного
стресса были проведены с использованием методов, которые не позволили корректно
проанализировать регуляцию гена (Molen et al., 2006). Регуляция и роль второй
альтернативной оксидазы микроорганизма, АОХ2, не изучалась совсем. В связи с этим
возникает вопрос о возможном разграничении функций между продуктами генов AOX1 и
AOX2 в разных условиях и возможной роли AОХ C. reinhardtii в качестве интегратора
стрессовых сигналов.
Цель работы состояла в изучении регуляции синтеза и активности альтернативных
оксидаз Chlamydomonas reinhardtii в стрессовых условиях.
В связи с этим были сформулированны следующие задачи исследования:
1. Охарактеризовать стрессовые условия, которые обуславливают увеличение
транскрипции АОХ-генов и приводят к возрастанию АОХ-зависимого дыхания в клетках
C. reinhardtii.
2. Выявить регулятор(ы) транскрипции, которые могут контролировать
экспрессию АОХ-генов в стрессовых условиях.
3. Оценить, насколько различны условия, в которых клетки C. reinhardtii
синтезируют две альтернативные оксидазы.
4. Экспериментально проверить существующую парадигму о том, что
представители субсемейства АОХ2 коститутивно экспрессируются и не индуцируются в срессовых условиях.
адаптируются к изменениям в окружающей среде. При этом, наличие у этой группы
микроорганизмов митохондрий и хлоропластов предполагает необходимость
координированного функционирования разных компартментов клеток и наличие
компартмент-специфичных механизмов, обеспечивающих эффективную адаптацию к
неблагоприятным факторам. Следует подчеркнуть, что в литературе практически не
обсуждается роль митохондрий в процессах адаптации и тех компонентов митохондрий,
которые обеспечивают защитно-адаптивные реакции фототрофных эукариотических
микроорганизмов в ответ на разные по природе стрессоры. Последнее обстоятельство
ограничивает существующие представления как о механизмах регуляции стрессовых
ответов, так и свойствах белков, функционирующих в митохондриях. В связи с этим
возникает необходимость изучения митохондриальных белков, которые выполняли бы
функцию интеграции метаболического состояния клетки с действием внешних стрессоров.
Один из механизмов клеточной защиты связан с функционированием
альтернативных оксидаз (AОХ), локализованных в митохондриях. Хотя АОХ выявлены у
эукариотических микроорганизмов, растений и грибов, изучались они главным образом у
высших растений (Vanlerberghe et al., 2013). У высших растений существует два типа
генов, кодирующих альтернативные оксидазы: AOX1, которые найдены у всех
проанализированных представителей, и AOX2, которые, по-видимому, ограничены только
двудольными растениями (Polidoros et al., 2009). Альтернативные оксидазы растений
представлены, как правило, многими белками. Так у Arabidopsis их пять: AOX1a, AOX1b,
AOX1c, AOX1d и AOX2. Столь многокомпонентная организация AOX, безусловно,
затрудняет анализ свойств каждого отдельного представителя. Предполагают, что у
высших растений альтернативные оксидазы могут действовать как центральные
регуляторы роста и развития, а также как интеграторы сигналов стрессовых условий
(Clifton et al., 2006; Vanlerberghe, 2013). В геноме модельного микроорганизма
Chlamydomonas reinhardtii выявлено два гена, AOX1 и AOX2, которые локализованы в
разных хромосомах (хромосомы 9 и 3, соответственно). Ген AOX1 C. reinhardtii
расположен в генетическом кластере, участвующем в ассимиляции нитратов (Gerin et. al,
2010, Molen et. al., 2006, Quesada et. al., 1993). Показано, что транскрипция AOX1 C.
reinhardti индуцируется нитратом и репрессируется аммонием, и AOX1-белок вовлечен в
контроль наиболее важных путей метаболизма микроорганизма (Gérin et al., 2010).6
Особенно следует подчеркнуть, что подобная регуляция альтернативной оксидазы
нитратом и аммонием уникальна для C. reinhardtii, а для высших растений характерна
противоположная зависимость: активация аммонием и репрессия нитратом. Вместе с тем,
роль AOX1-белка в стрессовых условиях совершенно не ясна. Сотрудниками лаборатории
впервые показана индукция AOX1 и возрастание доли альтернативного дыхания в
условиях теплового стресса (Zalutskaya, Lapina, Ermilova, 2015). Однако неизвестно,
какова роль AOX1 в условиях гипертермии, и вовлечена ли эта альтернативная оксидаза у
C. reinhardtii в защитно-адаптивные ответы микроорганизма на другие стрессовые
воздействия. Более ранние исследования некоторых авторов по анализу транскрипции
AOX1 в условиях незначительного снижения температуры (до 18°C) и окислительного
стресса были проведены с использованием методов, которые не позволили корректно
проанализировать регуляцию гена (Molen et al., 2006). Регуляция и роль второй
альтернативной оксидазы микроорганизма, АОХ2, не изучалась совсем. В связи с этим
возникает вопрос о возможном разграничении функций между продуктами генов AOX1 и
AOX2 в разных условиях и возможной роли AОХ C. reinhardtii в качестве интегратора
стрессовых сигналов.
Цель работы состояла в изучении регуляции синтеза и активности альтернативных
оксидаз Chlamydomonas reinhardtii в стрессовых условиях.
В связи с этим были сформулированны следующие задачи исследования:
1. Охарактеризовать стрессовые условия, которые обуславливают увеличение
транскрипции АОХ-генов и приводят к возрастанию АОХ-зависимого дыхания в клетках
C. reinhardtii.
2. Выявить регулятор(ы) транскрипции, которые могут контролировать
экспрессию АОХ-генов в стрессовых условиях.
3. Оценить, насколько различны условия, в которых клетки C. reinhardtii
синтезируют две альтернативные оксидазы.
4. Экспериментально проверить существующую парадигму о том, что
представители субсемейства АОХ2 коститутивно экспрессируются и не индуцируются в срессовых условиях.
1. Экспрессия гена АОХ1 индуцируется действием кадмия, что приводит к
увеличению уровней мРНК и белка, и возрастанию доли альтернативного дыхания.
2. Отсутствие света приводит к увеличению транскрипции генов АОХ1 и АОХ2.
3. Экспрессия гена АОХ2 положительно контролируется гипоксией и удалением
меди из среды.
4. В контроль транскрипции АОХ2-гена в условиях гипоксии и дефицита меди
вовлечен регуляторный белок CRR1.
увеличению уровней мРНК и белка, и возрастанию доли альтернативного дыхания.
2. Отсутствие света приводит к увеличению транскрипции генов АОХ1 и АОХ2.
3. Экспрессия гена АОХ2 положительно контролируется гипоксией и удалением
меди из среды.
4. В контроль транскрипции АОХ2-гена в условиях гипоксии и дефицита меди
вовлечен регуляторный белок CRR1.



