Анализ фенотипических проявлений мутаций в симбиотическом гене гороха Sym40, кодирующем ключевой регулятор развития азотфиксирующего клубенька
|
Список сокращений 4
Глава 1. Введение 5
Глава 2. Обзор литературы: Бобово-ризобиальный симбиоз как пример эффективных ассоциаций организмов в природе 7
2.1. Особенности ризобий в качестве объекта исследований 7
2.1.1. Общая характеристика представителей семейства Rhizobiaceae 7
2.1.2. Механизм работы нитрогеназы 8
2.2. Образование симбиотического клубенька 9
2.2.1. Влияние Nod-факторов на специфичность симбиоза 9
2.2.2. Ключевые этапы сигнального каскада инфекции 11
2.2.3. Инфекционный процесс и органогенез клубенька 12
2.2.4. Типы онтогенеза клубенька 15
2.2.5. Симбиотический процесс и мутации, приводящие к его нарушению 16
2.3. Роль фитогормонов в процессе образования клубенька 17
2.3.1. Цитокинины 18
2.3.2. Ауксин 18
2.3.3. Абсцизовая кислота 19
2.3.4. Другие фитогормоны 20
2.4. Процессы, протекающие в клубеньке 21
2.4.1. Ассимиляция аммония 21
2.4.2. Механизмы защиты нитрогеназы 21
2.5. Горох посевной как объект изучения бобово-ризобиального симбиоза 23
2.5.1. Общая характеристика 23
2.5.2. Ген EFD,кодирующий ключевой регулятор процесса клубенькообразования 23
2.5.3. Ген Sym40 — ортолог гена EFDу Pisum sativum 24
Глава 3. Материалы и методы 26
3.1. Объекты исследования 26
3.2. Условия культивирования штаммов Rhizobium leguminosarum bv. viciae 27
3.3. Методика выделения бактерий из клубеньков 27
3.4. Состав питательного раствора без азота 27
3.5. Условия выращивания растений и инокуляция 28
3.6. Условия выращивания растений в сосудах с почвой 28
3.7. Условия выращивания растений в стерильных контейнерах 29
3.8. Условия выращивания растений при исследовании влияния температуры на
клубенькообразование 30
3.9. Методика анализа гистологической структуры клубеньков с использованием тонких срезов 30
3.10. Методика анализа гистологической структуры клубеньков с использованием
полутонких срезов 32
3.11. Методика выращивания и обработки растений синтетическим аналогом цитокининов 33
3.12. Методика иммунолокализации абсцизовой кислоты 34
Глава 4. Результаты и обсуждение 35
4.1. Обоснование выбора модели для исследования 35
4.2. Анализ штаммов различного географического происхождения 35
4.3. Анализ клубенькообразования при выращивании опытных образцов в различных
типах почв 38
4.4. Анализ эффективных изолятов ризобий 39
4.5. Анализ влияния температуры на клубенькообразование 42
4.6. Анализ влияния обработки синтетическим цитокинином на проявление мутантного
фенотипа 44
4.7. Иммунолокализация абсцизовой кислоты 45
Выводы 52
Список литературы 53
Глава 1. Введение 5
Глава 2. Обзор литературы: Бобово-ризобиальный симбиоз как пример эффективных ассоциаций организмов в природе 7
2.1. Особенности ризобий в качестве объекта исследований 7
2.1.1. Общая характеристика представителей семейства Rhizobiaceae 7
2.1.2. Механизм работы нитрогеназы 8
2.2. Образование симбиотического клубенька 9
2.2.1. Влияние Nod-факторов на специфичность симбиоза 9
2.2.2. Ключевые этапы сигнального каскада инфекции 11
2.2.3. Инфекционный процесс и органогенез клубенька 12
2.2.4. Типы онтогенеза клубенька 15
2.2.5. Симбиотический процесс и мутации, приводящие к его нарушению 16
2.3. Роль фитогормонов в процессе образования клубенька 17
2.3.1. Цитокинины 18
2.3.2. Ауксин 18
2.3.3. Абсцизовая кислота 19
2.3.4. Другие фитогормоны 20
2.4. Процессы, протекающие в клубеньке 21
2.4.1. Ассимиляция аммония 21
2.4.2. Механизмы защиты нитрогеназы 21
2.5. Горох посевной как объект изучения бобово-ризобиального симбиоза 23
2.5.1. Общая характеристика 23
2.5.2. Ген EFD,кодирующий ключевой регулятор процесса клубенькообразования 23
2.5.3. Ген Sym40 — ортолог гена EFDу Pisum sativum 24
Глава 3. Материалы и методы 26
3.1. Объекты исследования 26
3.2. Условия культивирования штаммов Rhizobium leguminosarum bv. viciae 27
3.3. Методика выделения бактерий из клубеньков 27
3.4. Состав питательного раствора без азота 27
3.5. Условия выращивания растений и инокуляция 28
3.6. Условия выращивания растений в сосудах с почвой 28
3.7. Условия выращивания растений в стерильных контейнерах 29
3.8. Условия выращивания растений при исследовании влияния температуры на
клубенькообразование 30
3.9. Методика анализа гистологической структуры клубеньков с использованием тонких срезов 30
3.10. Методика анализа гистологической структуры клубеньков с использованием
полутонких срезов 32
3.11. Методика выращивания и обработки растений синтетическим аналогом цитокининов 33
3.12. Методика иммунолокализации абсцизовой кислоты 34
Глава 4. Результаты и обсуждение 35
4.1. Обоснование выбора модели для исследования 35
4.2. Анализ штаммов различного географического происхождения 35
4.3. Анализ клубенькообразования при выращивании опытных образцов в различных
типах почв 38
4.4. Анализ эффективных изолятов ризобий 39
4.5. Анализ влияния температуры на клубенькообразование 42
4.6. Анализ влияния обработки синтетическим цитокинином на проявление мутантного
фенотипа 44
4.7. Иммунолокализация абсцизовой кислоты 45
Выводы 52
Список литературы 53
На сегодняшний день одним из основных компонентов интенсивного земледелия является применение минеральных удобрений. Однако их широкое использование наносит серьезный урон окружающей среде (Mahanty et al.,2016). Также производство минеральных удобрений является энергоемким, поэтому в последние десятилетия активно развивается «адаптивное», «устойчивое» (от англ. sustainable) сельское хозяйство, направленное на производство экологически чистой продукции (Lal, 2008; Conway, Barbier, 2013; Altieri, 2018). Большой интерес в развитии адаптивного сельского хозяйства может представлять широкое использование генетических ресурсов микроорганизмов (Tikhonovich, Provorov, 2011).
При развитии симбиотических отношений между растениями и микроорганизмами наблюдается интеграция геномов макро- и микросимбионтов, что значительно повышает адаптационный потенциал растений (Тихонович и др., 2015). Бобово-ризобиальный симбиоз является одной из наиболее перспективных растительно-микробных систем для использования в адаптивном сельском хозяйстве (Tikhonovich, Provorov, 2011; de Vries, Bardgett, 2012; Rubiales, Mikic, 2015; Stagnari et al., 2017).
Наиболее распространенный тип бобово-ризобиального симбиоза формируется в результате взаимодействия а-протеобактерий, принадлежащих к порядку Rhizobiales (Kuykendall, 2015a), с представителями семейства Fabaceae (Brewin, 1991). Эти взаимоотношения являются очень продуктивными для растений, которые получают большое количество фиксированного атмосферного азота. Некоторые зернобобовые культуры, например, люцерна посевная (Medicago sativa L.), потенциально способны получать за сезон до 550 кг азота (Provorov, Tikhonovich, 2003). Успешность азотфиксации обеспечивается в результате развития на корнях бобовых растений специализированного органа — симбиотического клубенька, в котором создаются оптимальные условия для функционирования основного фермента фиксации азота — нитрогеназы (Oldroyd, 2013).
Наряду с огромной значимостью для сельского хозяйства данный тип симбиотических взаимоотношений представляет собой очень ценную модель для изучения различных аспектов функционирования эукариотической клетки, поскольку симбиотический клубенек является факультативном органом для растения; соответственно, возможно получение и изучение проявлений различных мутаций, нарушающих его развитие .
В настоящее время выявлено большое количество генов, контролирующих развитие и функционирование симбиотического клубенька (Цыганов, 2018). Тем не менее, многие аспекты работы этих генов остаются недостаточно изученными.
Таким образом, целью данной работы являлось изучение фенотипических проявлений мутаций в симбиотическом гене гороха Sym40,играющем важную роль в процессах развития клубенька.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Провести поиски штаммов, супрессирующих фенотипические проявления мутаций по гену гороха PsSym40.
1.1. Проанализировать способность серии эффективных штаммов различного географического происхождения Rhizobium leguminosarum bv. viciaeиз Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) формировать клубеньки на исходной линии SGE и мутантных линиях SGEFix--1 (sym40-1)и SGEFix--6 (sym40-2)и провести анализ фенотипа формируемых клубеньков.
1.2. Проанализировать клубенькообразование у мутантных линий SGEFix--1 (sym40-1} и SGEFix--6 (sym40-2), выращенных в почвах различного географического происхождения.
1.3. Проанализировать способность серии изолятов R leguminosarum,
супрессирующих симбиотические мутации гороха Pssym26и Pssym27,формировать клубеньки на мутантных линиях SGEFix--1 (sym40-R)и SGEFix -6 (sym40-2).
2. Проанализировать температурозависимость проявления мутантных фенотипов у линий гороха SGEFix--1 (sym40-1)и SGEFix--6 (sym40-2).
3. Проанализировать влияние синтетического аналога цитокинина (Б АП) на проявление мутантного фенотипа у линии гороха SGEFix--1 (sym40-R).
4. Провести иммунолокализацию стрессового гормона — абсцизовой кислоты в симбиотических клубеньках гороха линии дикого типа SGE и мутантной линии SGEFix--1 (sym40-1).
При развитии симбиотических отношений между растениями и микроорганизмами наблюдается интеграция геномов макро- и микросимбионтов, что значительно повышает адаптационный потенциал растений (Тихонович и др., 2015). Бобово-ризобиальный симбиоз является одной из наиболее перспективных растительно-микробных систем для использования в адаптивном сельском хозяйстве (Tikhonovich, Provorov, 2011; de Vries, Bardgett, 2012; Rubiales, Mikic, 2015; Stagnari et al., 2017).
Наиболее распространенный тип бобово-ризобиального симбиоза формируется в результате взаимодействия а-протеобактерий, принадлежащих к порядку Rhizobiales (Kuykendall, 2015a), с представителями семейства Fabaceae (Brewin, 1991). Эти взаимоотношения являются очень продуктивными для растений, которые получают большое количество фиксированного атмосферного азота. Некоторые зернобобовые культуры, например, люцерна посевная (Medicago sativa L.), потенциально способны получать за сезон до 550 кг азота (Provorov, Tikhonovich, 2003). Успешность азотфиксации обеспечивается в результате развития на корнях бобовых растений специализированного органа — симбиотического клубенька, в котором создаются оптимальные условия для функционирования основного фермента фиксации азота — нитрогеназы (Oldroyd, 2013).
Наряду с огромной значимостью для сельского хозяйства данный тип симбиотических взаимоотношений представляет собой очень ценную модель для изучения различных аспектов функционирования эукариотической клетки, поскольку симбиотический клубенек является факультативном органом для растения; соответственно, возможно получение и изучение проявлений различных мутаций, нарушающих его развитие .
В настоящее время выявлено большое количество генов, контролирующих развитие и функционирование симбиотического клубенька (Цыганов, 2018). Тем не менее, многие аспекты работы этих генов остаются недостаточно изученными.
Таким образом, целью данной работы являлось изучение фенотипических проявлений мутаций в симбиотическом гене гороха Sym40,играющем важную роль в процессах развития клубенька.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Провести поиски штаммов, супрессирующих фенотипические проявления мутаций по гену гороха PsSym40.
1.1. Проанализировать способность серии эффективных штаммов различного географического происхождения Rhizobium leguminosarum bv. viciaeиз Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) формировать клубеньки на исходной линии SGE и мутантных линиях SGEFix--1 (sym40-1)и SGEFix--6 (sym40-2)и провести анализ фенотипа формируемых клубеньков.
1.2. Проанализировать клубенькообразование у мутантных линий SGEFix--1 (sym40-1} и SGEFix--6 (sym40-2), выращенных в почвах различного географического происхождения.
1.3. Проанализировать способность серии изолятов R leguminosarum,
супрессирующих симбиотические мутации гороха Pssym26и Pssym27,формировать клубеньки на мутантных линиях SGEFix--1 (sym40-R)и SGEFix -6 (sym40-2).
2. Проанализировать температурозависимость проявления мутантных фенотипов у линий гороха SGEFix--1 (sym40-1)и SGEFix--6 (sym40-2).
3. Проанализировать влияние синтетического аналога цитокинина (Б АП) на проявление мутантного фенотипа у линии гороха SGEFix--1 (sym40-R).
4. Провести иммунолокализацию стрессового гормона — абсцизовой кислоты в симбиотических клубеньках гороха линии дикого типа SGE и мутантной линии SGEFix--1 (sym40-1).
1. Фенотипы мутантов гороха sym40не супрессируются полностью ни одним из проанализированных штаммов Rhizobium,что может свидетельствовать о значительном нарушении функционирования продукта этого гена — транскрипционного фактора PsEFD. Частично мутантный фенотип sym40-1супрессируется изолятом NaPi1.
2. Абсцизовая кислота участвует в функционировании клубеньков гороха, о чем свидетельствует ее накопление в меристеме и зоне инфекции, а также снижение ее уровня в аномально организованных клубеньках у мутанта sym40-1.
2. Абсцизовая кислота участвует в функционировании клубеньков гороха, о чем свидетельствует ее накопление в меристеме и зоне инфекции, а также снижение ее уровня в аномально организованных клубеньках у мутанта sym40-1.
Подобные работы
- Анализ фенотипических проявлений мутаций в симбиотическом гене гороха Sym40, кодирующем ключевой регулятор развития азотфиксирующего клубенька
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4700 р. Год сдачи: 2019