Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Совершенствование штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используемых в альфа-тесте для выявления генотоксических факторов

Работа №136743

Тип работы

Бакалаврская работа

Предмет

биология

Объем работы45
Год сдачи2019
Стоимость4300 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
67
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


ВВЕДЕНИЕ 3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1. Генетические основы альфа-теста 6
1.1 Жизненный цикл дрожжей Saccharomyces cerevisiaeи генетический контроль типа
спаривания 6
1.2 Альфа-тест и генетические события, учитываемые с его использованием 10
1.3 Штаммы дрожжей, используемые в альфа-тесте, и возможные направления их
совершенствования 14
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19
1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae 19
2. Плазмиды 20
3. Среды и условия культивирования 21
4. Трансформация 22
4.1 Трансформация дрожжей S. cerevisiae 22
4.2 Трансформация бактерий E. coli 22
5. Молекулярно-генетические методы 23
6. Методы частной генетики дрожжей 24
7. Альфа-тест 24
8. Качественное определение частоты возникновения «незаконных» гибридов 25
9. Статистические методы 25
РЕЗУЛЬТАТЫ 26
1. Модификация тестерного штамма, используемого в альфа-тесте, путём внесения
мутации mata2и проверка эффективности этой модификации в тесте на «незаконную» гибридизацию 26
2. Генетическая модификация дрожжевого штамма, используемого в альфа-тесте в
качестве партнёра для скрещивания и проверка его эффективности 28
2.1 Получение штамма G-10B-OM5, несущего промоторpGALlв центромере хромосомы
III и проверка эффективности этой модификации 29
2.2 Конструирование штамма GM-10B-OM5, несущего дополнительную копию локуса
MATaв левом плече и промоторpGALlв центромере хромосомы III и проверка эффективности его использования в альфа-тесте 30
ОБСУЖДЕНИЕ 36
ВЫВОДЫ 40
БЛАГОДАРНОСТИ 41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 42


Впервые химический мутагенез был описан в 40-е годы прошлого столетия в работах И. А. Рапопорта и Ш. Ауэрбах, независимо обнаруживших влияние некоторых веществ на частоту мутаций у дрозофилы. С тех пор был выявлен широкий спектр химических и физических агентов, способных повреждать генетический материал живых организмов. Агенты, потенциально способные влиять на стабильность генома, могут входить в состав фармацевтических препаратов, бытовой химии, косметических продуктов, пестицидов и инсектицидов, отходов промышленного производства, токсинов бактерий и грибов. К примеру, бутилпарабен и бисфенол А, обнаруженные в косметических продуктах, фармацевтике и пищевых продуктах, исследователи связывают с повреждениями ДНК в сперматозоидах (Oishi, 2002; Meeker et al., 2010). Мутагенным действием обладают также физические воздействия, например, ультрафиолетовое и ионизирующее излучения. Мутагенные факторы индуцируют повреждения ДНК, которые являются субстратом систем репарации. Абсолютное большинство повреждений ДНК эффективно устраняется системами репарации с полным восстановлением структуры и последовательности ДНК. Однако в результате ошибок систем репарации небольшая часть первичных повреждений может превращаться в наследуемые генные мутации или хромосомные перестройки, что приводит к негативным последствиям, таким как наследственные и онкологические заболевания, а также снижение жизнеспособности и ускорение процессов старения (Nasheuer, 2010). Несмотря на высокую эффективность репарации, достаточно большое количество повреждений ДНК может сохраняться до момента или возникать во время репликации ДНК, особенно на фоне воздействия сильных мутагенов, вызывающих серьезные нарушения структуры ДНК, такие как крупные аддукты и разрывы молекулы ДНК. При репликации поврежденной ДНК также с высокой частотой возникают генные, хромосомные и геномные мутации.
К 1960-м годам были накоплены обширные данные о потенциальной опасности некоторых мутагенов для человека. В связи с этим возникло новое направление исследований на стыке генетики, токсикологии и биохимии - генетическая токсикология, основной целью которого стала оценка способности химических веществ и физических факторов индуцировать мутации в клетках человека. В генетической токсикологии существуют две проблемы: во-первых, нет способа, позволяющего напрямую оценить мутагенную и канцерогенную опасность генотоксических факторов для человека, без вреда для самого человека, во-вторых, при массовых скринингах необходимо тестировать большой объем потенциально опасных мутагенов, что существенно повышает стоимость
тестирования на модели млекопитающих. Поэтому для проведения массовых тестов используют тест-системы, позволяющие выявлять определенные нарушения генетического материала на простых моделях. Создание универсальной тест-системы все еще не представляется возможным, поэтому были разработаны батареи тестов, состоящие из нескольких ГОСТированных тест-систем, которые дополняют друг друга и в разной степени решают указанные проблемы генетической токсикологии. Проверку различных веществ на наличие мутагенной активности проводят в несколько этапов (de Serres et al., 1980). На первом этапе с целью выявления потенциальных мутагенов, чаще всего используют тест Эймса, позволяющий выявлять реверсии у бактерий Salmonella typhimurium.Реже используют тесты на учет рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций или соматического мозаицизма у плодовой мушки Drosophila melanogaster, микроядерный тест полихроматофильных эритроцитов костного мозга грызунов. Тесты, используемые на начальном этапе, являются краткосрочными и наименее трудоемкими, что позволяет проводить быстрый скрининг большого количества факторов на наличие у них мутагенных свойств. Однако надежность результатов зависит от филогенетической близости тестера к человеку, поэтому вещества, показавшие мутагенную активность на первом этапе, рекомендуют ко второму и, при необходимости, третьему этапам тестирования. На заключительных этапах тестирования в основном используют методы учета мутаций в соматических и половых клетках млекопитающих и человека, таких как учет доминантных леталей в зародышевых клетках мышей, метод специфических локусов и транслокационный тест у мышей (Абилев и Глазер, 2015). После второго этапа мутагены либо однозначно запрещаются к использованию, либо, при незаменимости или особой значимости, проходят проверку на способность индуцировать мутации в половых клетках млекопитающих. Тесты на данных этапах являются дорогостоящими и длительными: метод изучения канцерогенной активности одного вещества на грызунах требует около двух лет работы и около 800 мышей и крыс на исследование одного вещества (Абилев и Глазер, 2015).
Уникальное положение среди известных тест-систем занимает пока не ГОСТированный альфа-тест, разработанный сотрудниками кафедры генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета. Его отличительной особенностью является способность выявлять фенотипическое проявление первичных повреждений до их исправления системами репарации ДНК и фиксации в форме генных или хромосомных мутаций, а также способность различать первичные повреждения и наследуемые изменения генетического материала (Репневская и др., 1989). Благодаря этим особенностям и широкому спектру регистрируемых нарушений использование альфа-теста может быть весьма перспективно для первичного скрининга мутагенных факторов. Также возможность выявлять разные по своей природе изменения ДНК может быть использована для изучения синергизма мутагенных эффектов.
К настоящему моменту проведён целый ряд научно-исследовательских работ, подтверждающих эффективность использования альфа-теста, а также опубликованы результаты исследований, в которых альфа-тест был использован в качестве главного метода для изучения процессов мутагенеза. (Inge-Vechtomov, 1985; Инге-Вечтомов и др., 1989; Репневская, 1989; Lemoine et al., 2005; Коченова и др., 2008; Kochenova et al, 2011; Андрейчук, 2012; Жук, 2016; Novoa et al., 2018). В ходе этих исследований были получены результаты, позволившие наметить направления для дальнейшего совершенствования и упрощения альфа-теста, что, безусловно, важно для ускорения внедрения метода в практику и повышения эффективности альфа-теста. На основе анализа имеющихся экспериментальных данных мы сформулировали ряд предложений по модификации штаммов дрожжей, которые, как мы ожидаем, приведут к усовершенствованию альфа- теста. Таким образом, целью данной работы является совершенствование альфа-теста, направленное на упрощение процедуры тестирования и повышение чувствительности тест- системы. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Модифицировать тестерный штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiaeпутём внесения мутации mata2.
2. Модифицировать штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae,используемый в альфа-тесте для регистрации переключения типа спаривания у тестерного штамма, путем внесения следующих модификаций III хромосомы: инсерция промотера pGALlв центромеру и инсерция дополнительной копии локусаMATaв левое плечо хромосомы III.
3. Разработать методику проведения альфа-теста с использованием полученных штаммов.
4. Оценить эффективность полученных штаммов для создания обновленной тест-системы.

Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

1. Использование штамма mata2в качестве тестерного приводит к возрастанию общей частоты «незаконной» гибридизации и частоты отдельных классов «незаконных» гибридов по сравнению со штаммом MATa2,что приблизительно на порядок повышает чувствительность альфа-теста в отношении спонтанных и УФ-индуцированных нарушений генетического материала.
2. В наибольшей степени использование мутации mata2способствует повышению чувствительности альфа-теста в отношении класса «мутации и временные повреждения», но не в отношении хромосомных нарушений.
3. Установлено, что генетическая модификация штамма-партнера для скрещивания, заключающаяся в инсерции pGALlв центромеру хромосомы III, эффективна для усовершенствования альфа-теста путем объединения тестов на «незаконную» гибридизацию и «незаконную» цитодукцию в рамках одной процедуры.
4. Дополнительная копия локуса MATa,внесенная в левое плечо хромосомы III, лишь незначительно снижает частоту образования «незаконных» гибридов, и поэтому такая модификация не эффективна для снижения влияния генетических нарушений в геноме штамма-партнера для скрещивания на общие результаты альфа-теста.



1. Абилев С.К., Глазер В.М. Мутагенез с основами генотоксикологии. Санкт-Петербург: Нестор-История, 2015., 304 с.
2. Андрейчук Ю.В. Идентификация событий, приводящих к переключению типа спаривания у гетероталличных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Диссертация магистра, СПб, СПбГУ, 2012.
3. Гланц С. Медико - биологическая статистика. М.: Практика, 1998, С. 327-345.
4. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов Н.Н. Биометрия. Учебное пособие. Л.: Изд. ЛГУ, 1982, C. 264.
5. Жук А. С., Задорский С. П., Ширяева А. А., Коченова О. В., Инге-Вечтомов С. Г., Степченкова Е. И. Идентификация мутации kar1-1, приводящей к повышению частоты цитодукции и снижению частоты гибридизации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. 2018. Т. 54, C. S18-S21.
6. Жук А.С. Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Диссертация на соискание ученой степени к.б.н., СПб, СПбГУ, 2016.
7. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. Л.: Наука, 1984, С. 143
8. Инге-Вечтомов С. Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика, 1971, T. 7, № 9, С. 113-123.
9. Инге-Вечтомов С. Г., Репневская М. В., Карпова Т. С. Изучение скрещивание клеток одинакового типа спаривания у дрожжей сахаромицетов // Генетика. 1986, T. 22, № 11, C. 2625-2636.
10. Коченова О.В., Борхсениус А.С., Степченкова Е.И., Инге-Вечтомов С.Г. Генетический контроль типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae как основа разработки тест- системы (а-тест) для оценки генетической активности эндогенных и экзогенных факторов// Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в “Наукограде”/Сборник Трудов Биологического института. СПб, 2008, № 54. С.89-100.
11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М. :Мир, 1984., 480 с.
12. Репневская М. В. Наследуемые и ненаследуемые изменения типа спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Дисс.канд.биол.наук., Ленинград, 1989, 210 c.
13. Репневская М. В., Кашкин П. К., Инге-Вечтомов С. Г. Модификационные изменения генетического материала у дрожжей сахаромицетов // Генетика. Т. 25, 1989, №3, С. 425 - 436.
14. Степченкова Е. И., Коченова О. В., Инге-Вечтомов С. Г. «Незаконная» гибридизация и «незаконная» цитодукция у гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae как система для анализа генетической активности экзогенных и эндогенных факторов в «альфа- тесте» // Вестник Санкт-Петербургского университета. Сер. 3, 2009, Вып. 4, С. 129-140.
15. Ширяева А.А. Совершенствование тест-системы для генетической токсикологии: выявление нового класса событий, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей S. cerevisiae. Диссертация магистра, СПб, СПбГУ, 2015.
16. Abraham J. Nasmyth K.A., Strathern J.N., Klar A.J.S., Hicks J.B. Regulation of mating-type information in yeast: Negative control requiring sequences both 5’ and 3’ to the regulated region// Mol Biol, 1984, V.176, P.307-331.
17. Aksenova A. Y., Greenwell P. W., Dominska M., Shishkin A. A., Kim J.C., Petes T. D., Mirkin
S. M. Genome rearrangements caused by interstitial telomeric sequences in yeast // PNAS, 2013, V. 110, P.49, 19866-19871
18. Bardwell L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway // Peptides., 2005, V.26., P. 339-350.
19. Bruhn, L., and G. F. Sprague Jr. MCM1 point mutants de- ficient in expression of alpha-specific genes: residues important for interaction with alpha 1 // Mol. Cell. Biol., 1994 , V. 14, P. 2534-2544.
20. Conde J., Fink G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion // Proceeding of the National Academy of Sciences USA, 1976, V. 73, № 10, P. 3651-5.
21. de Serres F., Hollaender A. Chamical mutagens. Principles and Methods for their detection, Plenum press, NY and London , 1986, V.6., P. 485.
22. Feldman J.B., Hicks J.B., Broach J.R. Identification of sites required for repression of a silent mating type locus in yeast // J. Mol. Biol, 1984, V. 178, P. 815-834.
23. Haber J. E. Mating-type genes and MAT switching in Saccharomyces cerevisiae // Genetics, 2012, V. 191, P. 33-64.
24. Hagen, D. C., L. Bruhn, C. A. Westby, and G. F. Sprague Jr. Transcription of alpha-specific genes in Saccharomyces cerevisiae: DNA sequence requirements for activity of the coregulator alpha 1 // Mol. Cell. Biol. 1993, V. 13, P. 6866-6875.
25. Herskowitz I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae// Microbiol, 1989, V.52, P.536-553.
26. Inge-Vechtomov S. G., Pavlov Y. I., Noskov V. N., Repnevskaya M. V., Karpova T. S., Khromov- Borisov N. N., Chekuolene J., Chitavichus D. Tests for genetic activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae: Study of forward and reverse mutation, mitotic recombination and illegitimate mating induction // Progress in mutation research. Evaluation of short-term tests for carcinogens: Report of the International Programme on Chemical Safety's collaborative study on in vitro assays/Amsterdam, The Netherlands Elsevier, 1985, P. 243-255.
27. Inoue T., Yamaguchi S., Saeki T., Sekiguchi K. Production of infectious swine vesicular disease virus from cloned cDNA in mammalian cells // J. Gen. Virol, 1990, V. 71, P. 1835-1842.
28. Kassir Y. Simchen G. Regulation of mating and meiosis in yeast by the mating-type region// Genetics, 1976, V.82, P.187-206.
29. Kochenova O.V., Soshkina Y.V., Stepchenkova E.I., Inge-Vechtomov S.G., Sherbakova P.V. Participation of translesion synthesis DNA polymerases in the maintenance of the chromosome integrity in yeast Saccharomyces cerevisiae// Biochemistry(Moscow), 2011, V.76, №1, P.49-60.
30. Kostriken, R., J. N. Strathern, A. J. Klar, J. B. Hicks, and F. Heffron A site-specific endonuclease essential for mating-type switching in Saccharomyces cerevisiae // Cell, 1983, V. 35, P. 167-174.
31. Lemoine F. J., Degtyareva N. P., Lobachev K.. Petes T. D. Chromosomal Translocations in Yeast Induced by Low Levels of DNA Polymerase: A Model for Chromosome Fragile Sites // Cell, 2005, V.120, P.587-598
32. Meeker J.D., Calafat A.M., Hauser R. Urinary bisphenol A concentrations in relation to serum thyroid and reproductive hormone levels in men from an infertility clinic // Environ Sci Technol, 2010, V. 44, P. 1458-1463.
33. Meeker J.D., Ehrlich S, Toth T.L., Wright D.L., Calafat A.M., Trisini A.T., Ye X., Hauser R. Semen quality and sperm DNA damage in relation to urinary bisphenol A among men from an infertility clinic // Reprod Toxicol, 2010, V. 30, P. 532-539.
34. Nasheuer H. Р. Genome Stability and Human Diseases // Subcellular Biochemistry, 2010, Vol. 50.
35. Nasmyth K.A. and Tatchel К. The structure of transposable yeast mating type loci// Cell, 1980, V.19, P.753-764.
36. Novoa C.A., Ang J.S., Stirling P.C. The A-like faker assay for measuring yeast chromosome III stability. // Methods Mol Biol. 2018; V. 1672: P. 1-9.
37. Oishi S. Effects of butyl paraben on the male reproductive system in mice // Arch Toxicol, 2002, V. 76, P. 423-429.
38. Reid R. J., Sunjevaric I., Voth W. P., Ciccone S., Du W., Olsen A. E., Stillman D. J., Rothstein R. Chromosome-scale genetic mapping using a set of 16 conditionally stable Saccharomyces cerevisiae chromosomes // Genetics, 2008, V. 180, № 4, P. 1799-808.
39. Rose M. D., Winston F., Hieter P. Methods in yeast genetics. CSHL Press, 1990, 198 с.
40. Siliciano P.G., Tatchell K. Transcription and regulatory signals at the mating-type locus in yeast // Cell, 1984, V. 37, P. 969-978.
41. Soni R, Carmichael JP, Murray JA. Parameters affecting lithium acetate mediated transformation of Saccharomyces cerevisiae and development of a rapid and simplified procedure. // Curr Genet. 1993, V 24, P. 455-459.
42. Stepchenkova E.I., Tarakhovskaya E.R., Siebler H.M., Pavlov Y.I. Defect of Fe-S cluster binding by DNA polymerase in yeast suppresses UV-induced mutagenesis, but enhances DNA polymerase-dependent spontaneous mutagenesis // DNA Repair, 2017, V. 49. P. 60-69.
43. Strathern J., Hicks J., Herskowitz I. Control of cell type in yeast by the mating type locus. The alpha 1-alpha 2 hypothesis // J Mol Biol, V. 147, 1981, № 3, P. 357-72.
44. Zakharov I. A., Yarovoy B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast // Mol Cell Biochem, 1977, V. 14, No 1-3, P. 15-8.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.



Подобные работы


©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.