Изучение кинетики агрегации мутантов прионного белка Sup35
|
Введение............................................................................................................................................................................2
Глава1. Обзор литературы 1.1. Общие сведения о процессе трансляции......................................................................................................3 1.2. Факторы терминации трансляции первого класса............................................................................4 1.3. Факторы терминации трансляции второго класса............................................................................5 1.4. Фактор [PSI+]...................................................................................................................................................6
Глава 2. Методы исследования белка sup35
2.1. Динамическое светорассеяние.......................................................................................................................72.2. Атомно-силовая микроскопия.......................................................................................................................92.3. Сканирующий электронный микроскоп.....................................................................................................112.4 Протоколы проведения экспериментов......................................................................................................13 2.4.1. Приготовление образцов для АСМ и СЭМ.........................................................................................13 2.4.2. Приготовление образцов для динамического светорассеяния..........................................................13 2.4.3. Фильтрация раствора с помощью центрикона....................................................................................14 2.4.4. Проведение эксперимента динамического светорассеяния..............................................................142.5. Метод обработки результатов, полученных в ходе динамического светорассеяния...............................15
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Исследование Sup35nm Wild Type (Дикий тип белка) ..........................................................................................19 3.1.1. Исследование времени агрегации Sup35nm WT.........................................................................................19 3.1.2. Изучение кинетики агрегации Sup35nm WT в зависимости от температуры...........................................24 3.2. Исследование изображений, полученных на АСМ...............................................................................................293.3. Исследование Sup35nm Mutation M0 (мутация М0) .............................................................................................323.3. Исследование Sup35nm Mutation M1 (мутация М1)..............................................................................................353.4. Исследование Sup35nm Mutation M2 (мутация М2)..............................................................................................373.5. Исследование Sup35nm Mutation M3 (мутация М3) .............................................................................................393.6. Исследование Sup35nm Mutation M3 (мутация М4) .............................................................................................413.7. Исследование Sup35nm Mutation M3 (мутация М5) .............................................................................................433.8.. Исследование агрегатов, полученных в ходе эксперимента ...............................................................................46
Выводы...............................................................................................................................................................................49 Список литературы...........................................................................................................................................................50
Глава1. Обзор литературы 1.1. Общие сведения о процессе трансляции......................................................................................................3 1.2. Факторы терминации трансляции первого класса............................................................................4 1.3. Факторы терминации трансляции второго класса............................................................................5 1.4. Фактор [PSI+]...................................................................................................................................................6
Глава 2. Методы исследования белка sup35
2.1. Динамическое светорассеяние.......................................................................................................................72.2. Атомно-силовая микроскопия.......................................................................................................................92.3. Сканирующий электронный микроскоп.....................................................................................................112.4 Протоколы проведения экспериментов......................................................................................................13 2.4.1. Приготовление образцов для АСМ и СЭМ.........................................................................................13 2.4.2. Приготовление образцов для динамического светорассеяния..........................................................13 2.4.3. Фильтрация раствора с помощью центрикона....................................................................................14 2.4.4. Проведение эксперимента динамического светорассеяния..............................................................142.5. Метод обработки результатов, полученных в ходе динамического светорассеяния...............................15
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Исследование Sup35nm Wild Type (Дикий тип белка) ..........................................................................................19 3.1.1. Исследование времени агрегации Sup35nm WT.........................................................................................19 3.1.2. Изучение кинетики агрегации Sup35nm WT в зависимости от температуры...........................................24 3.2. Исследование изображений, полученных на АСМ...............................................................................................293.3. Исследование Sup35nm Mutation M0 (мутация М0) .............................................................................................323.3. Исследование Sup35nm Mutation M1 (мутация М1)..............................................................................................353.4. Исследование Sup35nm Mutation M2 (мутация М2)..............................................................................................373.5. Исследование Sup35nm Mutation M3 (мутация М3) .............................................................................................393.6. Исследование Sup35nm Mutation M3 (мутация М4) .............................................................................................413.7. Исследование Sup35nm Mutation M3 (мутация М5) .............................................................................................433.8.. Исследование агрегатов, полученных в ходе эксперимента ...............................................................................46
Выводы...............................................................................................................................................................................49 Список литературы...........................................................................................................................................................50
Прион — это белок с аномальной трёхмерной (третичной) структурой, способный катализировать конформационное превращение гомологичного ему нормального клеточного белка в себе подобный. Прионами называют инфекционные или наследуемые факторы белковой природы, механизм распространения которых основан на их способности индуцировать конформационные изменения определённых полипептидов клетки. Белок в прионной изоформе меняет укладку такого же белка по “своему образу и подобию”, иными словами, играет роль пространственной матрицы. Фундаментальный интерес к этому феномену связан с тем, что он представляет собой новый способ копирования информации, “записанной” в трёхмерной структуре белка. Все известные прионы вызывают формирование амилоидов — белковых агрегатов, включающих плотно упакованные β-слои. Амилоиды представляют собой фибриллы, растущие на концах, а разлом фибриллы приводит к появлению четырёх растущих концов. Инкубационный период прионного заболевания определяется скоростью экспоненциального роста количества прионов, а она, в свою очередь, зависит от скорости линейного роста и фрагментации агрегатов (фибрилл). Для размножения приона необходимо исходное наличие нормально уложенного клеточного прионного белка; организмы, у которых отсутствует нормальная форма прионного белка, не страдают прионными заболеваниями. У млекопитающих прионы могут вызывать губчатую энцефалопатию (“коровье бешенство”), у человека некоторые прионы являются возбудителями таких инфекционных заболеваний, как Куру, болезнь Крейтсфельдта-Якоба, синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера и другие. Прионные белки также зачастую вызывают появление наследуемых черт, которые могут быть адаптивны (прионы низших эукариот). Появление приона [PSI+] в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae может приводить как к благоприятным, так и патологическим последствиям. Особенности проявления этого фактора преимущественно связаны с отличиями в трёхмерной укладке белка Sup35p в каждом конкретном случае. Изучение технологий, которые позволят поддерживать прионную конформацию, может существенно ускорить разработку лекарственных средств для терапии прионных заболеваний, которые, на данный момент, являются практически неизлечимыми.
Наиболее хорошо исследованный прион дрожжей - фактор [PSI+]. [PSI+] часто используют для различных фундаментальных исследований, так как основные механизмы его работы достаточно хорошо изучены и описаны во множестве научных работ. В ходе данной работы была подробно изучена кинетика агрегации как прионного белка Sup35 дикого типа (Wild Type), так и кинетика агрегации шести его мутантов, имеющих небольшие различия в химическом составе.
Наиболее хорошо исследованный прион дрожжей - фактор [PSI+]. [PSI+] часто используют для различных фундаментальных исследований, так как основные механизмы его работы достаточно хорошо изучены и описаны во множестве научных работ. В ходе данной работы была подробно изучена кинетика агрегации как прионного белка Sup35 дикого типа (Wild Type), так и кинетика агрегации шести его мутантов, имеющих небольшие различия в химическом составе.
Выводы 1. Показана возможность роста фибрилл мутаций белка Sup35nm на затравках дикого типа.
2. Спонтанная агрегация проходит существенно медленнее, чем агрегация в растворе при добавлении затравок дикого типа.3. Предложенный способ обработки результатов, полученных методом динамического светорассеяния, позволяет достоверно оценивать такие параметры, как скорость агрегации, время лаг-фазы, время фазы роста и т.д.
4. При исследовании белка Sup35nm дикого типа показано, что можно выделить 3 основных фракции: мономерная часть белка, агрегаты порядка 100-1000 нм и крупные агрегаты более 100 мкм, которые в растворе растут быстрее всего.
5. Проведен сравнительный анализ данных, полученных для Sup35nm дикого типа и шести его различных мутаций (Sup35nm Mutation M0 – Sup35nm Mutation M5). Для мутации М1 с течением времени показано появление новой фракции агрегированных структур (размеры структур пордяка 10000 нм) после ≈500 минут эксперимента. Мутация М2 показывает наиболее быструю фазу роста агрегатов, фиксируемую по возрастанию интенсивности рассеяния в растворе белка, что говорит о наибольшей склонности белка с этим типом мутации к агрегации. Мутации М0, М3, М4 и М5 практически не агрегируют в растворе, при этом мутация М5 обладает наибольшей устойчивостью к внешним воздействиям.6. Показано, что при температуре 40оС агрегация практически не происходит, однако при охлаждении до 30оС она приобретает выраженный характер.7. Получено соответствие данных динамического светорассеяния с изображениями, полученными методом АСМ.
2. Спонтанная агрегация проходит существенно медленнее, чем агрегация в растворе при добавлении затравок дикого типа.3. Предложенный способ обработки результатов, полученных методом динамического светорассеяния, позволяет достоверно оценивать такие параметры, как скорость агрегации, время лаг-фазы, время фазы роста и т.д.
4. При исследовании белка Sup35nm дикого типа показано, что можно выделить 3 основных фракции: мономерная часть белка, агрегаты порядка 100-1000 нм и крупные агрегаты более 100 мкм, которые в растворе растут быстрее всего.
5. Проведен сравнительный анализ данных, полученных для Sup35nm дикого типа и шести его различных мутаций (Sup35nm Mutation M0 – Sup35nm Mutation M5). Для мутации М1 с течением времени показано появление новой фракции агрегированных структур (размеры структур пордяка 10000 нм) после ≈500 минут эксперимента. Мутация М2 показывает наиболее быструю фазу роста агрегатов, фиксируемую по возрастанию интенсивности рассеяния в растворе белка, что говорит о наибольшей склонности белка с этим типом мутации к агрегации. Мутации М0, М3, М4 и М5 практически не агрегируют в растворе, при этом мутация М5 обладает наибольшей устойчивостью к внешним воздействиям.6. Показано, что при температуре 40оС агрегация практически не происходит, однако при охлаждении до 30оС она приобретает выраженный характер.7. Получено соответствие данных динамического светорассеяния с изображениями, полученными методом АСМ.
Содержание магистерской диссертации – Изучение кинетики агрегации мутантов прионного белка Sup35
Выдержки из магистерской диссертации – Изучение кинетики агрегации мутантов прионного белка Sup35