Введение 3
Цели и задачи 4
Литературный обзор 5
• I Гамма-интерферон 5
• II Методы получения рекомбинантных белков 8
• III Генномодифицированные растения-продуценты 10
• IV Съедобные иммуномодуляторы 16
• V Трансформация Agrobacterium (Rhizobium) rhizogenes 17
• VI Трансгенные растения без маркеров устойчивости 21
• VII Выбор растения-продуцента 24
Материалы и методы 25
Результаты 34
Выводы 59
Список литературы 60
С давних пор растения занимали в жизни человека немаловажную роль: они использовались в сельском хозяйстве, из их настоев делали лекарства, яды, а из стеблей мастерили изделия. В наше время к этому добавился новый способ использовать их на благо человечества, и сделать это мы можем при помощи генной инженерии.
В последнее время было проведено большое количество исследований, целью которых было создание генно-модифицированных растений, продуцирующих обладающие медицинским и ветеринарным значением белки человека и животных. Наряду с растениями для подобных целей используются и другие объекты (бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих), однако по сравнению с ними растения наделены рядом преимуществ. Так, например, растения не поражаются вирусами и прионами животных, обладают низкой себестоимостью.
Вопрос об иммунизации - как людей, так и животных - сейчас стоит остро. Это одно из главных направлений современной науки, и учёные ищут способы оберечь нас от болезней. Сделать это можно двумя путями: защищаться от каждого конкретного штамма или вируса (например, при помощи прививок) или же искусственно повышать иммунитет, повышая тем самым вероятность не стать носителем болезни. Последнее могли бы делать растения, содержащие иммуногенные вещества, будучи употреблёнными в пищу. Именно в этом направлении и работает одна из отраслей генной инженерии растений.
Существует несколько способов внедрения необходимой информации в геном растения для производства необходимого белка. Один из них - генетическая трансформация с помощью агробактерий. Можно с помощью Agrobacterium tumefaciens получать трансгенные каллусы, а из них регенерировать целые растения, несущие нужный ген. Однако этот способ требует продолжительного периода времени. Поэтому ещё одним из вариантов может быть получение бородатых корней с помощью A. rhizogenes. Бородатые трансгенные корни на растении несут в себе ген, кодирующий необходимый нам белок. Разумеется, корни могут показаться менее пригодными в пищу, чем целые растения. Однако, будучи добавлены в виде сухих добавок в корм скоту, генно-модифицированные бородатые корни можно применять в качестве съедобной вакцины. Такой способ иммунизации так же менее трудозатратен, чем обычная вакцина, введённая при помощи инъекции. Так же вакцина, полученная с пищей, не требует специальной очистки от возможных примесей.
Перспективными в подобной роли выглядят растения-продуценты интерферонов, которые являются мощными стимуляторами иммунной системы против патогенов вирусной природы и различных опухолей. Интерфероны – это семейство белков, образующихся в клетках позвоночных в ответ на вирусную инфекцию. Хотя интерферон не обладает прямым противовирусным действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его распространению.
В нашей лаборатории были созданы модифицированные растения табака с устойчивой продукцией биологически активного гамма-интерферона быка (Савельева и др., 2015; Burlakovskiy et al., 2015). Табак (Nicotiana tabacum L.) является удобным экспериментальным объектом, но ядовит для животных, к тому же использованная генетическая конструкция содержала селективный ген устойчивости к канамицину. Для повышения эффективности производства рекомбинантного гена и снижения экологических рисков, связанных с возможным распространением генов устойчивости, было решено создать трансгенные бородатые корни люцерны (Medicago truncatula), синтезирующие рекомбинантный интерферон и не содержащие селективных генов.
Цель работы:
Получить генетическую конструкцию, кодирующую IFN-γ с селективным маркёром и без него.
Задачи работы:
1. Создать вектор для трансформации растений, несущий ген гамма-интерферона под контролем р35S и селективный ген устойчивости к гигромицину.
2. Модифицировать вектор для трансформации с целью удаления селективного гена устойчивости
3. Провести агробактериальную трансформацию растений Medicago truncatula плазмидами, содержащими гены бычьего интерферона, в том числе и плазмидой без селективного маркера
4. Проанализировать наличие вставки Т-ДНК в растениях и сравнить эффективность трансформации разными плазмидами в присутствии и отсутствии селективного агента.
Выводы:
1. Созданы плазмиды для трансформации растений, несущие ген гамма-интерферона под контролем р35S промотора pHm43GW::p35S::sIFNG+::t35S, содержащие селективный ген устойчивости к гигромицину, и p43GW::p35S::sIFNG‑::t35S, без гена селективной устойчивости.
2. Проведена трансформация растений Medicago truncatula штаммами Agrobacterium rhizogenes и каллусов M. truncatula штаммами A. tumefaciens с использованием вышеобозначенных плазмид.
3. Последующий анализ выявил наличие вставки гена INFG, несущей селективный ген устойчивости, в ДНК, выделенной из каллусов. Эффективность трансформации бородатых корней без отбора на селективной среде была гораздо ниже, но один из образцов показал всего в 2,5 раза меньший уровень содержания гетерологичного гена, чем каллусы. Таким образом, имея большую выборку, можно получить трансгенные растения путем трансформации конструкцией без селективного гена устойчивости.
