Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
Введение
1. Обзор литературы
1.1. CLE пептиды и их участие в регуляции функционирования меристем высших
растений
1.1.1. Общая характеристика пептидных гормонов растений
1.1.2. Пептиды CLE: структура и классификация
1.1.3. Функции пептидов CLE
1.2. Рецепторы пептидов CLE
1.2.1. Общая характеристика рецепторов пептидов CLE
1.2.2. Рецептор TDIF RECEPTOR/PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM
(TDR/PXY)
1.2.3. Мембранные белки CORYNE (CRN) и CLAVATA2 (CLV2)
1.3. Развитие корнеплода и естественных опухолей у редиса
1.3.1. Развитие корнеплода редиса
1.3.2. Опухолеобразование у растений и естественные опухоли редиса
2. Материалы и методы
2.1. Растительный материал
2.2 Подбор праймеров для ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени
2.3. Выделение РНК из опухолевого материала и проверка наличия транскриптов при
помощи ОТ-ПЦР в реальном времени
2.4. Выделение геномной ДНК редиса и арабидопсис
2.5. Амплификация фрагментов геномной ДНК и трансляционное слияние фрагментов
2.6. Гель-электрофорез и выделение ДНК из агарозного геля
2.7. Клонирование фрагментов в векторы экспрессии методом GateWayTM
2.8. Трансформация бактерий Escherichia coli и Agrobacteruim rhizogenes
2.9. Выделение плазмид из бактериальных трансформантов
2.10. Проверка вставки в вектор при помощи ПЦР, рестрикции и секвенирования по3
Сэнгеру
2.11. Условия выращивания растений и трансформация при помощи Agrobacterium
rhizogenes
2.12. Приготовление микропрепаратов и конфокальная микроскопия
2.13. Приготовление препаратов для GUS-окрашивания
3. Результаты
3.1. Результаты ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени
3.2. Амплификация фрагментов ДНК и оптимизация протоколов ПЦР
3.3. Конструирование векторов экспрессии
3.4. Получение трансформантов A. rhizogenes
3.5. Получение растительного материала и растений-трансформантов
3.5. Проверка успешности трансформации растений при помощи конфокальной
микроскопии
4.6. Анализ трансгенных корнеплодов при помощи флуоресцентной микроскопии........50
4.7. GUS-окрашивание
4. Обсуждения
4.1. Результаты ОТ-ПЦР в реальном времени
4.2. Амплификация последовательностей интереса
4.3. Создание векторов
4.4. Трансформация растений
4.5. Выращивание растений в почве и получение опухолей и корнеплодов
4.6. Гистологический анализ препаратов при помощи флуоресцентной микроскопии....53
Выводы
Список литературы
Приложение 1: Использованные праймеры
Приложение 2: Протоколы ПЦР
Приложение 3: Полученные векторы
📖 Введение
Морфогенетические процессы в организме растений опосредованы активностью особых
тканей, или меристем, состоящих из недифференцированных мультипотентных клеток,
способных к пролиферации и последующей дифференциации в клетки любых других
тканей организма [Steeves, Sussex, 1989]. Несмотря на то, что подобная организация
пролиферирующих тканей значительно отличается от организации пула тканеспецифичных
стволовых клеток у животных, регуляция активности и идентичности стволовых клеток у
всех многоклеточных организмов демонстрирует ряд общих черт [Doonan, Sablowski, 2010].
Одной из таких черт является участие межклеточного сигналинга, опосредованного как
непосредственным контактом экспонированных на поверхности клеток молекул, так и
секрецией растворимых агентов в межклеточное пространство. У растений основным
механизмом подобных межклеточных взаимодействий является секреция в апопласт или в
проводящие ткани специфических сигнальных молекул, или фитогормонов. Сравнительно
недавно среди фитогормонов стали выделять отдельную группу низкомолекулярных
пептидов, обладающих разнообразными функциями. Данный класс сигнальных молекул
подразделяется на две группы: цистеин-богатые пептиды (CRPs) и пептиды, несущие
посттрансляционные модификации (PTM peptides) [Czyzewicz et al, 2013]. К последней
группе относятся пептиды семейства CLE, участвующие в регуляции активности и
поддержания всех имеющихся у растений типов меристем [Kucukoglu, Nilsson, 2015].
Латеральные меристемы (прокамбий и камбий) участвуют в процессах роста аксиальных
органов растения в ширину. В онтогенезе подобные процессы подразделяются на первичное
и вторичное утолщение, приводящие к появлению первичных и вторичных проводящих
тканей, соответственно. У некоторых растений подземные органы в ходе вторичного роста
существенно увеличиваются в поперечных размерах и приобретают запасающую функцию.
В частности, редис (Raphanus sativus L. var. radicola) из семейства Brassicaceae формирует
корнеплоды, являющиеся продуктом совместной деятельности камбия в главном корне и
нижней части гипокотиля. За счет накопления в корнеплоде ряда веществ, включая
углеводы, глюкозинолаты, фолат, аскорбат и различные вторичные метаболиты, редис
является важной сельскохозяйственной культурой [Chaturvedi, 2008; Curtis, 2003; Gutiérrez, Perez, 2004].
Помимо конститутивных меристем, таких как апикальные меристемы побега (Shoot Apical
Meristem, SAM) и корня (Root Apical Meristem, RAM) и камбий, растения формируют также
так называемые нерегулярные меристемы [Dodueva, Frolova, Lutova, 2007]. К результатам5
активности данного класса меристем относится широкий круг способных к росту и
ограниченной дифференциации объектов, таких как раневые каллусы, продукты
деятельности фитопатогенов и естественные опухоли некоторых растительных мутантов и
гибридов [Ahuja, 1998; Persinger, Christopher, 1991].
Одним из примеров образования естественных опухолей являются инбредные линии редиса
(Raphanus sativus L. var. radicola), формирующие опухоли на нижней половине корнеплода
при переходе к цветению [Il’ina et al, 2006]. Данные опухоли способны к росту на среде без гормонов, демонстрируют тканевую дифференциацию и слабый вторичный рост. Для
опухолей редиса показано наличие собственных очагов меристематической активности,
эквивалентных апикальным меристемам и отмеченных экспрессий ряда генов,
участвующих в сигнальной системе пептидов CLE [Lebedeva Osipova et al, 2015]. В связи с
этим представляется интересным проследить паттерн экспрессии ряда генов, относящихся
к пептидному сигналингу, в частности, генов рецепторов пептидов CLE, в опухолевых
меристемах.
Целью данной работой является выявление локализации рецепторов к пептидам CLE, а
именно PXY, CLV2 и CRN, в корнеплоде редиса, а также в спонтанных опухолях у
опухолеобразующих линий. Данные рецепторы были выбраны исходя из имеющихся
данных об их участии в регуляции работы камбия, за счет активности которого и происходит
утолщение корнеплода в ходе его развития.
Объектом работы послужил редис инбредных линий 19 и 28 из коллекции кафедры
генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета. Данные
линии различаются по признаку опухолеобразования.
В рамках выдвинутой гипотезы мы ожидаем обнаружить в корнеплоде паттерн экспрессии
генов интереса в камбии, а также в очагах спонтанной меристематеческой активности, в то
время как в опухолях предполагается увидеть менее упорядоченный паттерн из-за слабой
гистологической дифференцированности опухолевого материала.
Для успешного достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи:
1. Проанализировать литературу по заявленной теме.
2. Убедиться в наличии транскриптов генов интереса в опухолях при помощи ОТ-ПЦР.6
3. Амплифицировать необходимые фрагменты генома редиса.
4. Создать репортерные конструкции с использованием GUS и eGFP методом Gateway
и клонировать их в векторы экспрессии.
5. Трансформировать бактерии A. rhizogenes с использованием полученных векторов.
6. Трансформировать растения редиса двух линий, различающихся по признаку
опухолеобразования, с использованием A. rhizogenes.
7. Получить трансгенные корнеплоды для обеих исследуемых линий растений и
трансгенные опухоли для опухолеобразующей линии
8. Проанализировать паттерн экспрессии репортерных конструкций в трансгенных
корнеплодах и опухолях с использованием методов флуоресцентной микроскопии и
гистохимии.
9. Сравнить результаты, полученные для корнеплодов и спонтанных опухолей
трансгенных растений.
✅ Заключение
В ходе данной работы были получены следующие выводы:
1. В опухолях редиса наблюдается экспрессия генов RsPXY, RsCRN и RsCLV2, при этом
уровень экспрессии не отличается от уровня экспрессии в главном корне растения.
2. Получены последовательности промоторов, кодирующих последовательностей и
терминаторов для генов RsPXY, RsCRN и RsCLV2, причем промоторы RsCRN и RsCLV2
успешно амплифицированы с использованием праймеров для соответствующих
последовательностей арабидопсис.
3. С использованием полученных последовательностей были получены репортерные
конструкции с GUS и eGFP, а также соответствующие трансформанты для E. coli и A.
rhizogenes.
4. Для ряда полученных конструкций получены трансгенные растения. Для растений,
трансформированных AtCRN::AtCRN-eGFP и AtCLV2-eGFP, экспрессия трансгена
продемонстрирована при помощи флуоресцентной микроскопии.
5. Оптимизация условий выращивания в закрытом грунте позволяет получать цветущие и
образующие корнеплод растения вне привязки к естественному вегетационному периоду