Влияние состава питательного субстрата и способа культивирования на биологическую активность экстрактов и метаболитные профили гриба Pestalotiopsis sp.,выделенного из листьев Camellia sinensis
ВВЕДЕНИЕ
1. Литературный обзор
1.1. Характеристика грибов рода Pestalotiopsis.
1.2. Биологически активные метаболиты грибов рода Pestalotiopsis
2 . Материалы и методы исследования
2.1. Оборудование, используемое в работе
2.2. Материалы исследований
2.2.1. Растворители
2.2.2. Тест-организмы
2.3. Методы исследований
2.3.1. Молекулярная идентификация гриба
2.4. Выделение биологически активных метаболитов
2.4.1. Получение экстрактов из жидкофазной культуры гриба
2.4.2. Получение экстрактов из твердофазной культуры гриба
2.5. Оценка биологической активности
2.5.1. Фитотоксическая активность
2.5.2. Антимикробная активность
2.6. Анализ хроматографичеких профилей экстрактов
2.6.1. Тонкослойная хроматография
2.6.2.Высокоэффективная жидкостная хроматография
2.7. Статистическая обработка результатов
3. Результаты и обсуждение
3.1 Идентификация гриба
3.1.1. Морфолого-культуральные характеристики изучаемого объекта
3.1.2. Молекуляно-генетические данные
3.2. Жидкофазное культивирование
3.3. Твердофазное культивирование
3.4. Оценка биологической активности экстрактов
3.4.1. Фитотоксическая активность
3.4.2. Антибиотическая активность
3.5. Анализ метаболитных профилей экстрактов Pestalotiopsis sp
3.5.1. Тонкослойная хроматография
3.5.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ ПО РАБОТЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Pestalotiopsis - род аскомицетов. Грибы рода Pestalotiopsis паразиты и сапрофиты на
растениях, так же встречаются как эндофиты. Очень обширный род, большинство грибов,
описанных как виды Pestalotiopsis обработаны в монографии Наг Раджа (Nag Raj, 1993),
который с уверенностью признает в нём 25 видов, однако в списках нерассмотренных и не
исключенных видов грибов осталось около 110 видов, которые ожидают критического
пересмотра своего таксономического положения.
Из числа видов, описанных в монографии Наг Раджа (Nag Raj, 1993) отнесенных к
роду Pestalotiopsis, на территории России и других республик бывшего СССР встречается по
крайней мере три вида. Одним из них является Pestalotiopsis theae, распространенный
паразит чая. Особенностью фитопатогенных видов рода Pestalotiopsis является то, что гриб
способен поражать даже молодые побеги чайного куста, тем самым нанося вред
производству чайной продукции.
Род является космополитом, но особенно распространен в тропиках и субтропиках.
Предполагается, что изначально, виды Pestalotiopsis были изолированы именно как
эндофиты из растительных тканей. Эндофитные виды остаются безвредными до тех пор,
пока растение не подвергнется стрессу, а затем эндофиты становятся патогенами. Считается,
что патогенная фаза может быть вызвана комбинацией факторов окружающей среды,
восприимчивостью растений и вирулентностью патогена (Gehlot et al., 2008). Однако
необходимы дальнейшие исследования для доказательства эндофитной патогенной взаимосвязи.
На сегодняшний день из видов Pestalotiopsis выделяют алкалоиды, терпеноиды,
производные изокумарина, кумарины, хиноны, пептиды, ксантоны, производные ксантонов,
фенолы, фенольные кислоты и лактоны, что делает этот род особенно богатым источником
биологически активных веществ.
Цель работы:
Подобрать питательные субстраты и способы культивирования для получения
биологически активных метаболитов Pestalotiopsis sp., выделенного из листьев Camellia
sinensis.
Задачи исследования:
1. Провести идентификацию гриба на основе морфологических признаков и
молекулярно-генетических данных.5
2. Оценить выход биомассы и экстрактивных веществ при культивировании на
различных жидких и твердых субстратах
3. Оценить биологическую активность (фитотоксическую и антимикробную)
экстрактов из культуры продуцента, полученных на различных питательных субстратах
4. Провести сравнительный анализ метаболитных профилей (ТСХ- и ВЭЖХ)
экстрактов из культуры гриба, полученных при культивировании на различных питательных субстратах
В результате данной работы из гербарного образца чая Camellia sinensis, собранного
на чайных плантациях в районе Дагомыса (Краснодарский край), в чистую культуру был
выделен гриб, который по морфолого-культуральным характеристикам был отнесен к роду
Pestalotiopsis. Дальнейший анализ по локусу большой субъединицы РНК показал, что
наиболее близким видом к изучаемому микромицету является P. camelliale. Литературные
данные о вторичных метаболитах P. camelliale отсутствуют.
Для анализа вторичных метаболитов продуцента использовали жидкие и твердые
питательные субстраты. По окончании культивирования гриба оценивали выход биомассы и
экстрактивных веществ. Для экстрактов, полученных из культурального фильтрата, мицелия
и твердофазной культуры Pestalotiopsis sp. оценивали антимикробную и фитотоксическую
активности.
Наиболее высокая фитотоксическая и антимикробная активность была выявлена для
экстрактов из культурального фильтрата гриба на жидких средах, в частности, картофельноглюкозном бульоне, среде M1D и ДМГ. Для экстрактов из культурального фильтрата гриба
на среде ЧАВ были отмечены самые низкие показатели. Выход биомассы и экстрактивных
веществ, а также активность экстрактов были самые низкие по сравнению с другими
питательными средами. Можно заключить, что данная среда является не подходящей для
получения биологически активных веществ.
В целом, наибольшее разнообразие метаболитов Pestalotiopsis sp. было отмечено для
экстрактов из культуры гриба на жидких средах. В дальнейшем возможно провести
оптимизацию условий культивирования для увеличения выхода биоактивных метаболитов, а
также расширить круг тест-организмов для оценки фитотоксической и антимикробной
активности.
Стоит отметить, что по данным литературы ранее у экстрактов из культуры грибов
рода Pestalotiopsis, выделенных с чая не оценивали фитотоксичность. Быстрое накопление
биомассы, а также наличие данной активности у экстрактов, полученных из культуры
изучаемого объекта делает его потенциальным продуцентом веществ с гербицидной и
антимикробной активностью.
В дальнейшем, точная идентификация в купе с анализом метаболитного профиля
позволяет выявлять новые хемотаксономические маркеры родов и видов, а также дает
дополнительные возможности для целенаправленного поиска метаболитов определенной
структуры у представителей близкородственных видов.